龙血竭提取物促进创面愈合的实验研究

刘辉辉 肖丹 郑晓 顾岩 郭善禹

创面愈合是外科领域中的重要问题，糖尿病、截瘫、局部放射线损伤等所致的创面难以愈合[1-2]。促进创面愈合的治疗方法包括清创、应用抗生素、组织移植和应用生长因子等。中草药因疗效确切、适应证广泛、价廉、使用方便等特点，至今仍被广泛使用。许多中草药已被证明具有促进创面愈合的功能[3-4]。龙血竭（Resina Draconis）为剑叶龙血树树干产生的红色树脂，多用于活血化瘀、消炎止痛等。现代药理学研究表明，龙血竭具有良好的活血化瘀、抗栓、抗氧化、抗菌消炎等生理活性[5-6]。近年来，临床应用龙血竭治疗难愈性创面，具有良好的疗效。本实验运用乙醇提取法制备龙血竭提取物，并作用于大鼠创面，为探讨龙血竭促进创面愈合的生物学机制，提供可靠的实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物、主要仪器与试剂

SD大鼠48只，体质量170～200 g，雄性，由上海交通大学医学院附属第九人民医院实验动物中心提供；龙血竭由上海交通大学医学院附属第九人民医院药剂科提供；CD31单克隆抗体（Epitomics公司）；VEGF 单克隆抗体 （Epitomics公司）；Trizol（Invitrogen公司）；SYBR Green荧光定量试剂盒（Takara 公 司）；Stratagene Mx3000P （Stratagene 公司）；Image Pro Plus软件（Media Cybernnetics公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 药物提取与植物成分化学分析

龙血竭100 g，用95%乙醇浸泡 48 h，过滤，收集乙醇液，过滤并蒸馏回收乙醇，得干燥红色结晶，即为龙血竭提取物。龙血竭提取物软膏由5 g提取物与100 g凡士林混匀而成。

植物化学成分定性分析参考Harborne和Kokate等方法[7]，检测发现乙醇提取物中有黄酮类、强心苷类、三萜类、酚类、生物碱类和皂甙类化合物。

1.2.2 动物模型与实验分组

将健康成年48只SD大鼠随机分为对照组、湿润烧伤膏组 （MEBO组）、龙血竭乙醇提取物组（RDEE组）3组，每组16只。将各组大鼠腹腔注射麻醉，剃去背部毛发后于大鼠背部中上作一直径为1.8 cm的圆形全层皮肤创面，将凡士林、MEBO和RDEE软膏涂于无菌纱布上，面积与创面相当，覆盖于创面并包扎。术后单笼饲养，隔日换药，自由饮食。

1.3 结果检测

1.3.1 创面愈合率与愈合时间

于大鼠伤后3 d、7 d、11 d和15 d，肉眼观察，记录创面愈合情况。数码相机拍照，Image Pro Plus软件分析，计算创面愈合率。观察创面愈合情况，以完全上皮覆盖作为创面愈合标准[8]。

1.3.2 组织病理学检测

于术后 3 d、7 d、11 d、15 d 各组取 3 只大鼠的创面组织。将创面组织用4%多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋切片 （厚度 4 μm），HE、Masson染色，光镜下观察组织炎症反应、成纤维细胞、新生血管和肉芽组织等[9]。

1.3.3 CD31免疫组化染色与创面微血管密度（MVD）计算

石蜡切片于70℃恒温箱中烘烤30 min，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水。室温下滴加0.3%过氧化氢甲醛溶液，10 min后PBS洗涤3次。0.1%胰蛋白酶37℃，30 min，PBS洗涤 3次。 DAB 室温 30 min，甩干。滴加一抗CD31，1∶500稀释，4℃过夜。PBS洗涤3 次。滴加二抗（anti-Rabbit）37 ℃，30 min。PBS 洗涤3次，显色5 min，并用PBS充分冲洗。苏木素复染1 min，自来水充分冲洗 30 min。梯度乙醇脱水、二甲苯透明。中性树脂封片并加盖玻片，自然晾干。

创面微血管密度（MVD）计算，每张切片光镜下观察，胞质呈棕黄色者为CD31表达阳性细胞，以CD31表达阳性细胞或细胞簇作为1个血管计数单位，在低倍镜（40×）下选择微血管密度最高的3个区域，于高倍镜（200×）下计数3个视野的MVD，取其平均数为该标本的MVD[10]。

1.3.4 创面肉芽组织VEGF mRNA表达检测

使用Trizol试剂盒抽提组织总RNA，并反转录成cDNA。采用SYBR Green荧光定量试剂盒进行聚合酶链反应。引物序列，VEGF forward：5'-CACCA AAGCAGCACATAGGAGA-3'，reverse：5'-TTACAC GTCTGCGGATCTTGGACA-3'；GAPDH forward：5'-GAACGGGAAGCTCACTGGC-3'，reverse：5'-GCATG TCAGATCCACAACGG-3'。扩增条件为 95 ℃，30 sec；60℃，30 sec， 共 40循环，72℃，5 min。 以 GAPDH为内参，Stratagene Mx3000P进行SYBR Green荧光定量PCR分析，每个样品重复3管。

1.3.5 Western Blot分析VEGF的表达

组织匀浆后用RIPA裂解液提取组织蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定浓度。10%SDS-PAGE电泳后转移至硝酸纤维素膜，37℃封闭2 h，加一抗，4℃孵育过夜（VEGF，1∶200），以辣根过氧化物酶标记的二抗37℃孵育2 h，PBST漂洗3次，每次10 min，ECL发光X线片显影，GAPDH作为内参。用ImagePro Plus 6.0软件分析结果。

1.4 统计学处理

采用SPSS16.0软件分析，所有数据以均值±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组均数间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 创面愈合率和愈合时间

术后第 3、7、11、15 天 MEBO 和 RDEE 组创面愈合率均高于对照组 （P<0.05），MEBO组和RDEE组之间差异无统计学意义（图1）。对照组、MEBO组和RDEE组的创面平均愈合时间分别为 （18.67±0.82） d、（14.16±0.75） d 和（15.12±0.75） d，MEBO 组和RDEE组愈合时间与对照组相比约提前3.5 d，有显著差异 （P<0.05），MEBO组和RDEE组相比无明显差异。

图1 各组创面愈合率比较Fig.1 Comparison of healing rate in control,MEBO and RDEE group(**:versus control group,P<0.01)

2.2 组织形态学观察

HE染色显示，三组均可观察到创面愈合过程中肉芽组织的各种细胞结构，MEBO组和RDEE组可观察到较多的成纤维细胞、新生血管和较少的炎性细胞，与对照组有明显差异。Masson染色显示，MEBO组和RDEE组比对照组创面肉芽组织中成纤维细胞和新生胶原较多、胶原排列有序（图2）。

图2 术后7天各组组织形态学观察Fig.2 Histological observation of each group 7 days after treatment by HE and Masson staining

图3 术后7天各组免疫组织化学检测结果Fig.3 Histochemical observation of each group 7 days after treatment

2.3 免疫组织化学检测和微血管密度

新生血管形成伴随创面愈合全过程。CD31为内皮细胞标志物之一。免疫组化染色显示，MEBO组和RDEE组CD31阳性率较高，与对照组有明显差异（图3）。伤后7 d时，三组MVD均呈上升趋势，MEBO组和RDEE组在术后第11天达高峰，与对照组差异显著（P<0.05）（表 1）。

表1 各组各时间点MVD的比较Table 1 The comparison of MVD in each group at different time point

2.4 创面组织VEGF表达量的检测

VEGF是一种对血管生成有极强诱导作用的多功能诱导因子，是已知促血管生成最强的细胞因子。RDEE组VEGF mRNA和VEGF蛋白的表达明显高于对照组 （P<0.05），MEBO组VEGF mRNA的表达也明显高于对照组（P<0.05）（图 4，5）。

图4 术后第7天各组VEGF mRNA的表达Fig.4 VEGF mRNA expression in each group(**:versus control,P<0.01)

图5 术后7天各组VEGF蛋白表达Fig.5 VEGF expression in each group by western blot(*:versus control,P<0.05)

3 讨论

创面愈合是外科领域的重要问题，是一个复杂而有序的生物过程[11]，主要包括细胞趋化、结缔组织细胞增生、细胞外基质蛋白沉积及重排、上皮细胞迁移与增生，最终导致创面再上皮化，恢复组织的完整性和连续性。皮肤结构一旦遭到破坏，组织修复程序开始启动进行快速有效的修复[12]。传统理论上将创面愈合人为划分为三个重叠有序的阶段，即：炎症反应阶段、组织细胞增生阶段和组织重塑阶段。创面再上皮化、创面胶原的沉积和创面血管的新生是创面愈合主要的特征。三者的发生发展相辅相成，又互为条件的。

创面愈合率和愈合时间是最直接而有效的创面愈合评价指标。本实验采用大鼠背部圆形皮肤切除模型证实，使用龙血竭乙醇提取物软膏能有效提高创面愈合率和降低创面愈合时间，与对照组相比创面平均愈合时间缩短3.5 d。

胶原沉积增加和新生血管增多有利于促进创面的愈合[13]。胶原代谢在创面愈合中占据重要地位，是构成修复组织的主要细胞外基质成分，为创面修复过程中，组织血管化和上皮化提供支架，对于修复过程的完成有着极其重要的作用。创面愈合过程中，胶原代谢的情况反映了创面愈合的情况[14]。创面新生血管发生于伤后即刻，新生的血管为创伤部位提供氧、营养物质和生物活性物质，并能促进肉芽组织的生长，对创伤修复具有重要作用。微血管的数量关系到组织修复能否得到充足的血流和氧供，若创面有相对足够的新生血管形成[15]，创面组织将得到充足的营养物质和氧，创面愈合速度将得到加快。本实验中，HE染色显示RDEE组炎性细胞浸润较少、微血管较多，与对照组有明显差异；Masson染色显示RDEE组成纤维细胞数量多，胶原排列有序，相对胶原含量明显高于对照组；MEBO组和RDEE组的MVD逐渐升高，于第11天达到高峰；在第3、7、11天，RDEE组MVD都明显高于对照组。

此外，许多类型的细胞因子和生长因子与创面愈合过程中的肉芽组织形成、新生血管形成和再上皮化等过程有着密切的联系[16]，其中VEGF已被证实是唯一对血管形成具有特异性的生长因子。VEGF参与了创面愈合的各个阶段，不仅能够引起细胞外基质成分改变、诱导新生血管形成、减少瘢痕组织的产生和减少感染的发生[17-18]，还可增加血管通透性，促进细胞因子和生长因子的分泌，从而加速创面愈合[19]。本实验结果显示，RDEE组VEGF表达明显高于对照组。

龙血竭为治疗皮肤疮疡和创伤的常用药物，具有活血化瘀、去腐生肌、收敛止血等双向调节作用。现代药理学研究表明，龙血竭具有良好的活血化瘀、抗氧化、抗菌消炎的生理活性[20-21]。植物药学成分分析表明，龙血竭乙醇提取物含有黄酮类、三萜类、生物碱类、酚类等化合物。黄酮类和三萜类等植物化学成分已被证实具有抗菌、收敛、抗氧化等作用[22]。因此，对龙血竭提取物有效成分的分离与研究仍需进一步深入。

[1] Sen CK,Gordillo GM,Roy S,et al.Human skin wounds:a major and snowballing threat to public health and the economy[J].Wound Repair Regen,2009,17(6):763-771.

[2] King L.Impaired wound healing in patients with diabetes[J].Nurs Stand,2001,15(38):39-45.

[3] Lodhi S,Pawar RS,Jain AP,et al.Wound healing potential of Tephrosia purpurea(Linn.)Pers.in rats[J].J Ethnopharmacol,2006,108(2):204-210.

[4] Mahmood AA,Khaled AA,Hapipah MA,et al.Wound healing activities of Rafflesia hasseltii extract in rats[J].J Clin Biochem Nutr,2009,45(3):304-308.

[5] Choy CS,Hu CM,Chiu WT,et al.Suppression of lipopolysaccharide induced of inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 by Sanguis Draconis,a dragon's blood resin,in RAW 264.7 cells[J].J Ethnopharmacol,2008,115(3):455-462.

[6] Gupta D,Gupta RK.Bioprotective properties of Dragon's blood resin:in vitro evaluation of antioxidant activity and antimicrobial activity[J].BMC Complement Altern Med,2011,11:13.

[7] Harborne JB.Photochemical Methods[M].London:Chapman&Hall,1998,60-66.

[8] Rashed AN,Afifi FU,Disi AM.Simpleevaluation of the wound healing activity of a crude extract of Portulaca oleracea L.(growing in Jordan)in Mus musculus JVI-1[J].J Ethnopharmacol,2003,88(2-3):131-136.

[9] Akkol EK,Koca U,Pes I,et al.Exploring the wound healing activity of Arnebia densilora(Nordm.)Ledeb.by in vivo models[J].J Ethnopharmacol,2009,124(1):137-141.

[10] Pareek G,Shevchuk M,Armenakas NA,et al.The effect of finasteride on the expression of vascular endothelial growth factor and microvessel density:a possible mechanism for decreased prostatic bleeding in treated patients[J].J Urol,2003,169(1):20-23.

[11] Ansurudeen I,Sunkari VG,Grünler J,et al.Carnosine enhances diabetic wound healing in the db/db mouse model of type 2 diabetes[J].Amino Acids,2012,43(1):127-134.

[12] Arulprakash K,Murugan R,Ponrasu T,et al.Efficacy of Ageratum conyzoides on tissue repair and collagen formation in rats[J].Clin Exp Dermatol,2012,37(4):418-424.

[13] Shukla A,Rasik AM,Dhawan BN.Asiaticoside-induced elevation of antioxidant levels in healing wounds[J].Phytother Res,1999,13(1):50-54.

[14] Maehata Y,Takamizawa S,Ozawa S,et al.Type III collagen is essential for growth acceleration of human osteoblastic cells by ascorbic acid 2-phosphate,a long-acting vitamin C derivative[J].Matrix Biol,2007,26(5):371-381.

[15] Roy H,Bhardwaj S,Yla-Herttuala S.Biology of vascular endothelial growth factors[J].FEBS letters,2006,580(12):2879-2887.

[16] Lim JS,Yoo G.Efects of adipose-derived stromal cells and of their extract on wound healing in a mouse model[J].J Korean Med Sci,2010,25(5):746-751.

[17] Bates DO,Jones RO.The role of vascular endothelial growth factor in wound healing[J].Int J Low Extrem Wounds,2003,2(2):107-120.

[18] Corral CJ,Siddiqui A,Wu L,et al.Vascular endothelial growth factor is more important than basic fibroblastic growth factor during ischemic wound healing[J].Arch Surg,1999,134(2):200-205.

[19] Corral CJ,Siddiqui A,Wu L,et al.Vascular endothelial growth facto r is more important than basic ibroblastic growth factor during ischemic wound healing[J].Arch Surg,1999,134(2):200-205.

[20] Peres MTLP,DelleMonache F,Cruz AB,et al.Chemical composition and antimicrobial activity of Croton urucurana Baillon(Euphorbiaceae)[J].J Ethnopharmacol,1997,56(3):223-226.

[21] Gurgel LA,Sidrim JJC,Martins DT,et al.In vitro antifungal activity ofdragon’sblood from Croton urucurana against dermatophytes[J].J Ethnopharmacol,2005,97(2):409-412.

[22] Tsuchiya H,Sato M,Miyazaki T,et al.Comparative study on the antibacterial activity of phytochemical flavanones against methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J].J Ethnopharmacol,1996,50(1):27-34.