海参卵中类胡萝卜素提取条件的优化

杨 利 伟，许 兆 滨，张 春 枝，杨 希，毕 妍

(1.大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034；2.辽宁省大连海洋渔业集团公司，辽宁 大连 116113)

0 引 言

类胡萝卜素(carotenoids)是一种天然产物的总称。迄今为止，人类在自然界中已发现600多种天然的类胡萝卜素[1]。天然类胡萝卜素主要存在于高等植物中，在藻类、微生物和海洋软体动物壳体内也有分布。目前类胡萝卜素的生产方法主要有化学合成、天然提取和微生物发酵[2]。类胡萝卜素在食品、饲料、医药、保健品、化妆品等领域已被广泛应用。类胡萝卜素在防癌、增强免疫力、保护细胞免受损伤、增强肌肉耐力等方面都有特殊的贡献[3－5]。

海参卵(sea cucumber ovum)，俗称海参花，是海参加工过程中的副产物。海参卵和海参体壁有着同样丰富的营养成分，如多糖、核酸、性腺色素等[6]。近年来中国海参产业发展迅速，而海参卵的回收利用一直被人们所忽视，对其中应用价值巨大的类胡萝卜素类物质的提取分析意义重大。本实验以海参加工副产物海参卵为原料，提取其中的类胡萝卜素类物质，结合现代分析方法，优化了提取条件，为海参卵的综合利用及类胡萝卜素的深入研究提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

海参卵，大连棒棰岛海产企业集团有限公司；乙酸乙酯、无水乙醇、丙酮、石油醚，天津科密欧化学试剂有限公司；去离子水，实验室供应。

1.2 仪 器

722S分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；台式高速离心机(TGL－16G)，上海安亭科学仪器厂；恒温水浴锅(HS－3001)，太仓市科教仪器厂；干燥箱(766－3型远红外)，上海三星电热仪器厂。

1.3 方 法

1.3.1 原料含水量测定

称取冻鲜海参肠卵10g放入105℃恒重的玻璃皿中，105℃烘干至恒重，减重法测定。水分质量分数计算公式为

式中：w(水)为水的质量分数，%；m1为称量瓶和试样质量，g；m2为称量瓶和试样干燥后质量，g；m3为称量瓶的质量，g。

1.3.2 类胡萝卜素的提取

类胡萝卜素属于脂溶性色素，可采用有机溶剂浸提法，不同结构的类胡萝卜素要使用不同的溶剂进行萃取[7]。称取一定量的原料，按比例加入提取溶剂，在恒温下浸提一定时间，离心得类胡萝卜素提取液，迅速测定吸光值。

1.3.3 类胡萝卜素的定性定其量分析

薄层层析法定性，以硅胶板为固定相，以V(氯仿)∶V(甲醇)＝95∶5为展开剂，对海参卵有机溶剂提取液和类胡萝卜素标准品进行薄层层析，硝酸银喷雾显色[8]，对比样品Rf值、斑点颜色和斑点大小，初步判定提取液的成分。

分光光度法定量，按照最佳提取条件提取得到的提取液，以空白试剂调零，在类胡萝卜素最大吸收波长450nm下测定吸光值。类胡萝卜素质量分数按照下面公式计算[9]：

式中：w(类胡萝卜素)为类胡萝卜素质量分数，μg／g；OD450为吸光值；D为稀释倍数；V为提取溶剂所需体积，mL；E1%1cm为百分消光系数，此处取值0.25；m为原料质量，g。

1.3.4 提取溶剂的选择

选取丙酮、乙酸乙酯、石油醚、乙醇4种常用溶剂，在其他条件一致的前提下，比较4种溶剂的提取效果，确定最佳提取溶剂。

1.3.5 提取级数与溶剂量的选择

考察倍数溶剂一次提取与分级提取的关系。首先选择10倍溶剂量一次提取，然后将10倍溶剂量分成5倍、3倍、2倍3个等级，浸提3次，结果同一次提取对比，比较类胡萝卜素质量分数与溶剂用量的关系。

1.3.6 海参卵中类胡萝卜素最优提取条件的确定

首先进行单因素试验，以料液比、提取时间、提取温度为因素，其他条件一致的情况下，考察单一因素的不同水平对提取效果的影响。在单因素试验的基础上，选用L9(33)正交试验设计，对海参卵中类胡萝卜素的提取工艺进行优化，确定最适工艺条件。

2 结果与分析

2.1 原料含水量测定结果

根据恒重法测定原料的水分质量分数，按照实验方法“1.3.1”中公式计算样品中水的质量分数，测3组取均值，结果表明冻鲜海参卵中水的质量分数为90.56%。

2.2 薄层层析结果

以V(氯仿)∶V(甲醇)＝95∶5为展开剂，以类胡萝卜素标准品为对照，进行薄层层析，结果如图1所示。

图1 薄层色谱图Fig.1 The thin layer chromatogram

第2个斑点与类胡萝卜素标准品斑点Rf值一致，斑点形状和硝酸银显色后颜色基本一致，可以初步确定样品中该组分为类胡萝卜素。

2.3 提取溶剂的选择

精确称取4份冻鲜海参卵0.3g放置于离心管中，分别加入3mL的丙酮、乙酸乙酯、石油醚、乙醇，迅速转入预热好的40℃的水浴锅中，避光浸提2h，间歇振荡。提取后离心，取上清液，在450nm波长可见光下以提取溶剂为空白对照，测定其吸光值，并计算出类胡萝卜素质量分数，结果见图2。由图2可以看出，乙酸乙酯的提取效果最好，且其毒性最小，价格适中，故选用乙酸乙酯为提取溶剂进行后面的单因素试验。

2.4 提取级数与溶剂量的选择

准确称取0.3g原料2份，1份使用10倍溶剂1次提取，另1份选用10倍溶剂量分级提取，第1次提取溶剂量为5mL，第2次为3mL，第3次为2mL，提取率按照最优提取条件下类胡萝卜素质量分数计算，结果见表1。

图2 不同提取溶剂对提取效果的影响Fig.2 Effect of different solvent on extraction

表1 提取级数与溶剂用量的确定Tab.1 Experimental conditions for the extract times and solvent volume

由表1的提取结果可知，二次分级提取的提取率比一次提取的略低，但所用溶剂量比一次提取的少，为提高提取效率节约溶剂，可采用二级提取。

2.5 单因素试验

2.5.1 料液比的选择

精确称取5份冻鲜海参卵0.3g于离心管中，按比例加入1.2、1.8、2.4、3.0、3.6mL乙酸乙酯，40℃水浴避光浸提2h，提取过程间歇振荡。提取后离心、取上清液，在450nm波长可见光下以提取溶剂为空白对照，测定其吸光值，并计算出类胡萝卜素质量分数，结果如图3所示。

图3 提取溶剂倍数对提取效果的影响Fig.3 Effect of different multiple solvent on extraction

由图3可以看出，随着提取溶剂倍数的增加，类胡萝卜素质量分数越来越大，8～12倍溶剂提取效果相差不大，为了节约溶剂，可以选择8倍或者10倍溶剂量。

2.5.2 提取时间的选择

精确称取7份冻鲜海参卵0.3g于离心管中，各加入3mL乙酸乙酯，40℃水浴避光浸提，浸提时间分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0h，提取过程间歇振荡。提取后离心，取上清液，在450nm波长可见光下以提取溶剂为空白对照，测定其吸光值，并计算出类胡萝卜素质量分数，结果如图4所示。

图4 提取时间对提取效果的影响Fig.4 Effect of extract time on extraction

由图4可以看出，在1～3h时，提取时间越长，提取效果越好，3h达到最高点，再延长提取时间，类胡萝卜素质量分数反而下降，可能是由于类胡萝卜素类物质不稳定容易失活，故应选取3h为提取最佳时间。

2.5.3 提取温度的选择

精确称取6份冻鲜海参卵0.3g分别于离心管中，各加入3mL乙酸乙酯，分别在25、30、35、40、45、50℃水浴下避光浸提3h，提取过程间歇振荡。离心，取上清液在450nm波长可见光下以提取溶剂为空白对照，测定其吸光值，并计算出类胡萝卜素质量分数，结果见图5。

图5 提取温度对提取效果的影响Fig.5 Effect of extract time on extraction

由图5可以看出，提取温度为40℃时提取效果最好，温度继续升高，质量分数反而下降，可能温度过高会破坏类胡萝卜素结构使其失活，故选择提取温度为40℃作为单因素试验的最佳提取温度。

2.6 正交试验

在单因素试验的基础上，利用L9(33)正交试验表，进一步对提取条件进行优化。正交试验设计以及正交试验方差分析见表2、3。

表2 海参卵中类胡萝卜素提取条件正交试验设计及其结果Tab.2 Orthogonal test of carotenoids extract conditions design and result

表3 方差分析表Tab.3 Analysis of covariance table

以乙酸乙酯为提取溶剂，正交试验结果及分析表明，各因素对海参卵中类胡萝卜素质量分数的影响顺序为C(提取温度)＞A(料液比)＞B(提取时间)，其中提取温度为显著性影响因素(a＝0.05)，方差分析结果和极差分析结果相一致，所以确定最佳提取条件组合为A2B2C3，即料液比为1∶12、提取时间3h、提取温度40℃，类胡萝卜素质量分数可达63.20μg／g。

3 结 论

类胡萝卜素性质极其不稳定，遇光、热、空气都容易分解，结构发生变化，而且导致吸光度下降，提取和测量时应该尽量在避光低温下进行。

薄层层析结果表明海参卵中含有一定比例的类胡萝卜素类物质。冻鲜海参卵中水分质量分数为90.56%。通过单因素试验结合正交试验分析得知，海参卵中类胡萝卜素的最佳提取条件为：以乙酸乙酯为提取溶剂，提取温度40℃，提取时间3h，料液比1∶12，类胡萝卜素质量分数可达63.20μg／g。两级提取的类胡萝卜素提取率可达94.23%，比一级提取提取率高且节省提取溶剂。

[1]惠伯棣.类胡萝卜素化学及生物化学[M].北京：中国轻工业出版社，2005：1－2.

[2]李福枝，刘飞，曾晓希，等.天然类胡萝卜素的研究进展[J].食品工业科技，2007，28(9)：227－231.

[3]ZEB A，MEHMOOD S.Carotenoids contents from various sources and their potential health applications[J].Pakistan Journal of Nutrition，2004，3(3)：199－204.

[4]CAPELLI B，CYSEWSKI G.Natural astaxanthin：the king of the carotenoids[M].Holualoa：Bob Capelli Cyano－tech Corporation，2007：1－3.

[5]MATSUNO T.Aquatic animal carotenoids[J].Fisheries Science，2001，67：771－783.

[6]赵鸿霞，周大勇，秦磊，等.响应面法优化海参卵酶解工艺[J].食品与机械，2010，26(5)：114－117.

[7]姬小明，邵惠芳，刘金霞，等.类胡萝卜素的提取及分离方法研究进展[J].河南科学，2008，26(11)：1337－1339.

[8]黄晨.万寿菊中类胡萝卜素的分离及性质研究[D].天津：天津商业大学，2008：34－35.

[9]黄健，刘建国.类胡萝卜素的分析测定[J].青岛化工学院学报，2001，22(3)：223－227.