乙二醇/丝素蛋白共混膜的研究

钱巧芬，张珊珊，侯 静，吴 琪，卢神州

(1.苏州大学纺织与服装工程学院，江苏苏州215123;2.南通苏州大学纺织研究院，江苏苏州215123)

几个世纪以来，蚕丝作为一种纺织材料，因其特殊的光泽和良好的机械性能而广为人知［1］。蚕丝能被溴化锂、硫氰酸锂、硫氰酸钙、氯化钙等的浓溶液溶解［2］，从而加工成其他形态的材料，如直径为微米级和纳米级的丝素纤维、丝素膜、丝素水凝胶、多孔材料、球状骨针、胶囊等［3］。一般认为，丝素蛋白除了无规卷曲结构，还存在SilkⅠ和SilkⅡ两种结晶结构。研究表明，湿热法、有机溶剂法和拉伸处理法能够促使丝素蛋白从无规卷曲向β-折叠结构转变［4］，最终使得丝素蛋白材料不溶于水。得益于其良好的生物相容性，很多种类的细胞能在丝素膜上生长［5］。人角膜内皮细胞可以在丝素膜上生长，表明丝素膜可以用于角膜移植［6］。人角膜成纤维细胞在丝素膜及丝素多孔材料上培养结果表明，丝素蛋白材料对角膜组织的修复有重大的利用价值［7］。但是丝素溶液直接浇铸在基质上，待液体挥发并最终转变为固相，得到的丝素膜脆性较大，强度不够，且易溶于水［8］，使其应用于角膜的修复受到限制。因此，如何改善丝素蛋白膜的水溶性及透明性，使其更加符合人角膜移植的要求是目前角膜组织修复的一个热点。目前有些文献采用丝素蛋白与其他化合物或天然高聚物共混合来改善其水溶性及生物相容性［9］。丝素蛋白溶液与山梨醇或肌醇共混，可以制备出不溶于水的透明丝素膜［10］，但是两种共混膜只能在干态下保持较好的透光率，在湿态时透光率不理想，使其在角膜修复工程上的应用受到了限制。因此，需要寻求一种醇类化合物，在将其与丝素蛋白混合后，共混膜在干、湿态都能保持良好的透光率。

将一定比例的聚乙二醇混入丝素膜可使膜在保持原有良好生物性质前提下改善膜的柔韧性，且透光性较好，但因其聚合物相对分子量较大，故与丝素的可混性稍差［11］。因此，本文考虑采用相对分子量较小的乙二醇，与丝素共混的方法制得丝素蛋白透明共混膜，对其结构和性能进行了研究，并在其上培养L929细胞，研究其生物相容性。

1 试验与方法

1.1 丝素蛋白共混膜的制备

家蚕生丝置于质量分数为0.05%的Na2CO3溶液中，于98～100℃处理30 min，重复3次，脱去生丝中的丝胶。洗净干燥后的纯丝素纤维在65℃下溶解于9.3 mol/L的溴化锂溶液中，透析3 d后过滤得到纯丝素溶液。

取40 mL丝素溶液，按乙二醇/丝素质量分数分别为 0︰10、1︰10、2︰10、3︰10、4︰10、5︰10、6︰10 的比例向丝素溶液中加入相应质量的乙二醇，混合均匀后倒入聚苯乙烯塑料模具中，在室温下于通风橱中风干即得共混膜。

1.2 结构表征

使用全自动X'PERT PRO MPD射线衍射仪(荷兰帕纳科公司)，CuKα射线，在管电压40 kV﹑管电流35 mA﹑扫描速度10°/min的条件下，记录得到2θ=5°～45°的衍射强度曲线。用Nicolet 5700 FI-IR型傅立叶变换红外光谱仪测试，将共混膜加工成直径小于80 μm的粉末后，KBr压片制样，测试4 000～400 cm-1吸光度得到共混膜的红外吸收光谱。

1.3 溶失率测定

将共混膜在恒温恒湿(25℃，相对湿度65%)下平衡24 h，每个称取质量W1(g)的样品3块，然后在烘箱中105℃烘至恒重。称重得到W2(g)。含水率C的计算公式:

将共混膜在恒温恒湿(25℃，相对湿度65%)环境中平衡24 h，然后准确称取0.1 g左右的样品W1，放入锥形瓶中，按浴比1︰100加入去离子水，37℃水浴预热30 min后在37℃的水浴恒温震荡器中震荡24 h，然后取出溶液。用Smartspec型紫外分光光度计测出溶液在278 nm下的吸光度A。共混膜的丝素蛋白溶失率D计算公式:

式中:K为丝素溶液的紫外吸光常数，K=1.102 6。

剩下的丝素膜固体用去离子水冲洗3遍后放入105℃烘箱中烘干得W2。共混膜的质量溶失率Z计算公式:

1.4 力学性能测试

使用美国Instron3365型万能材料试验机进行测试，拉伸速度为20 mm/min，夹距为28 mm，试样是按照GB/T1040—2006标准工字3型刀具压出的样条。测试干态强力前将样条在恒温恒湿(25℃，相对湿度65%)中平衡24 h;湿态强力测试则是将样品于生理盐水中浸泡24 h后，取出擦干测定。

1.5 透光率测定

将共混膜平铺置于24孔板板底，用酶标仪(BIO-TEK SYNERGY)分别测定 492、550 nm及700 nm处的吸光度值(A)。干态透光率直接铺板测定。测试湿态下的透光率时，先将膜在去离子水中浸泡24 h，再将其平铺于培养板底，加入1 mL去离子水进行测试。不同波长下各检测4个孔，取平均值。透光率T计算公式:

1.6 降解性

选取质量分数为30%的乙二醇共混膜分别用tris缓冲溶液和蛋白酶-ⅩⅣ溶液降解，对照样为用体积分数75%乙醇浸泡2 h的纯丝素膜。将两种材料于去离子水中浸泡72 h后取出，干燥后称取降解样品0.1 g置入离心管中，按浴比1︰100分别向其中加入10 mL的tris缓冲溶液，2 U/mL的蛋白酶ⅩⅣ溶液，放置于37℃的水浴恒温震荡器中降解，每两天换液一次。分别于第1、3、6、9、12、15 d 取出样品，每个时间点重复3次，用去离子水充分洗涤后干燥并称重，计算出失重率，将第3 d的样品制成粉末用于X射线衍射。

1.7 细胞相容性

将含乙二醇质量分数为30%的丝素溶液直接加入24孔板风干成膜，对照样为经体积分数75%乙醇处理过的纯丝素膜。取处于对数生长期的L929细胞，胰酶消化后用完全培养基制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×105个/mL，每孔加入1 mL细胞悬液，两种材料各重复4孔，置于CO2培养箱中培养。分别于接种后1、3、5 h计数未黏附的细胞数，计算细胞的黏附率。取处于对数生长期的L929细胞，胰酶消化后用完全培养基制成细胞悬液，调整细胞浓度为2×104个/mL，每孔加入200 μL细胞悬液，两种材料各重复6孔，置于CO2培养箱中培养，隔天换液。分别于 1、3、5、7、9 d，每孔加入20 μL摩尔浓度为50 μmol/L的树脂天青溶液，并于培养箱中孵育6 h;在酶标仪上测定其荧光强度(FLU 值，激发波长530 nm，发射波长 590 nm)［12］，测定细胞增殖率。

2 结果与分析

2.1 丝素蛋白膜的结构

乙二醇/丝素共混膜的X衍射曲线和红外光谱图分别如图1(a)和图1(b)所示。由图1(a)中可以看出纯丝素膜主要以无定形结构为主，曲线b～g均在 12.2°、19.7°、24.7°、28.2°、32.3°、36.8°处有衍射峰出现，这说明乙二醇主要是诱导丝素蛋白由无规结构向Silk I结晶结构转变;另外当乙二醇/丝素质量比为 5/10、6/10(图中的 f，g)时，2θ在 9.1°出现了Silk II的衍射峰，说明随着乙二醇浓度的升高，逐渐形成Silk II型结晶结构。

图1 丝素蛋白共混膜的结构Fig.1 Structure of blend silk fibroin membranes

由图1(b)可以看出，纯丝素膜的红外吸收峰在1 651.5 cm-1(酰 胺 I)，1 542 cm-1(酰 胺 II)，1 244 cm-1(酰胺 III)，属于无规卷曲结构［13］。乙二醇/丝素质量比为1/10、2/10、3/10(图中的 b，c，d)时，共混膜中的丝素蛋白在酰胺I、酰胺II、酰胺III区的吸收峰均在1 653.8、1 541.9、1 242 cm-1附近，与纯丝素膜的吸收峰位置相近，由于在红外谱图上难以区分α螺旋与无规卷曲，结合前面的X射线衍射结果，可以得出这3种比例的乙二醇/丝素共混膜中的丝素蛋白均为α螺旋构象。当乙二醇/丝素质量比为4/10、5/10(图中的 e，f)时，共混膜在酰胺 I、酰胺 II区的吸收峰变宽;继续增加乙二醇的浓度，共混膜逐渐在1 629 cm-1处出现新的吸收峰，1 653.8 cm-1处的吸收峰也逐渐变弱，这说明，当乙二醇/丝素质量比超过4/10时，共混膜中的α螺旋构象逐渐减少，β折叠构象逐渐增多。

由此可知，当乙二醇浓度较低时，其主要促进丝素蛋白由无规结构向Silk I结晶结构转变，而当乙二醇/丝素为6/10时，有部分丝素蛋白向Silk II结晶结构转变。

3.2 溶失率

乙二醇/丝素共混膜的热水溶失率如图2所示。在图2(a)中可以看出，乙二醇质量分数为10%时，共混膜的丝素蛋白溶失率就从纯丝素膜的90%降至5%以下，继续增加乙二醇的含量，丝素蛋白的溶失率几乎不变。因此可知，当加入的乙二醇的质量占丝素蛋白质量的10%时，丝素膜就开始不溶，故可以通过将乙二醇与丝素蛋白共混解决丝素蛋白的水溶性问题。

在图2(b)中，乙二醇质量分数为10%时，共混膜中的乙二醇几乎全部溶出，随着乙二醇浓度的升高，共混膜的质量损失率呈缓慢上升趋势，当乙二醇/丝素质量比为6/10时，质量损失率约为20%，故可知共混膜中的乙二醇还有部分未溶出。

图2 丝素蛋白膜的溶失率Fig.2 Dissolve-loss rate of silk fibroin membranes

3.3 力学性能

乙二醇/丝素共混膜在干态和湿态下的力学性能如图3所示。在干态下，共混膜的强度随着乙二醇含量的增加而下降，应变则随着乙二醇含量的增加先增大后减小，这说明乙二醇对丝素蛋白起到增塑作用。同时可以看出，当乙二醇质量分数为30%时，共混膜柔韧性最好，所以可以通过调控乙二醇的质量分数来制备出所需的力学性能的丝素蛋白膜。

图3 丝素蛋白膜的力学性能Fig.3 Mechanical property of silk fibroin membranes

从图3(b)中可以看出，在湿态下，共混膜的强度随着乙二醇质量分数的增大而下降，伸长率变化的规律也是如此。

3.4 透光性

人眼角膜的透光率随着波长的增加而上升，在450 nm处约为80%，在500 nm处接近90%，700 nm以上时透光率趋于稳定约为95%［14］。干、湿态下的共混膜在450、500、700 nm波长下的透光率如图4所示。由图4(a)可以看出，在干态下，共混膜的透光率极好，均在90%以上，且乙二醇含量的增加对干态透光率影响不大。由图4(b)可以看出，与干态相比，共混膜湿态透光率略有下降，但仍有着较高的透光率，且其透光率均在90%以上。由此可见，乙二醇丝素蛋白共混膜透光率接近人的角膜，可望用于人的眼角膜修复材料。

图4 透明丝素蛋白膜的透光性Fig.4 Light transmission of transparent silk fibroin membranes

3.6 体外降解

乙二醇/丝素共混膜在蛋白酶XIV溶液中的降解情况如图5所示。纯丝素膜和乙二醇/丝素共混膜在tris缓冲溶液中几乎不降解。从图5(c)可以看出，纯丝素膜在蛋白酶溶液中，质量分数呈线性下降，在第15 d的时候，质量分数下降至50%左右。共混丝素膜则在降解第1 d的时候，质量分数就下降至35%左右，在第3 d时，下降至13%左右，最后在第6 d时几乎全部降解，质量分数还剩6%左右，之后质量分数变化不明显。可见蛋白酶XIV对Silk I结构的丝素膜降解作用较强。

图5 丝素膜在降解过程中的质量分数变化Fig.5 Weight changes of silk fibroin membranes during enzymatic degradation

3.7 细胞相容性

L929细胞在两种丝素膜上的黏附率如图6所示。从图6可以得知，细胞在共混丝素膜上的黏附率较好，在1 h后就达到了80%以上，并随着时间的增加继续增加。通过SPSS软件分析，乙二醇共混膜与纯丝素膜的细胞黏附率无显著性差异，但要优于纯丝素膜。

图6 L929细胞在透明丝素膜上的黏附率Fig.6 Cell attachment of L929 cells on transparent silk fibroin membranes

图7 L929细胞在不同材料上培养不同天数的生长形态Fig.7 Phase contrast light microscope images of L929 cells cultured different days on different silk fibroin membranes

用倒置相差显微镜观察细胞的生长形态，如图7所示。从图7可以看出，第1 d时，细胞数目较少，不同材料间没有明显差异;第3 d时，细胞数目明显增多，说明两种材料增殖均较好，纯丝素膜和共混膜上的细胞形态较好，细胞呈梭形、三角形以及多边形，分散也较均匀;培养第5 d时，两种材料上的细胞均铺满整个视野，并开始有圆缩细胞产生，细胞数目没有明显差异。总体看来，共混膜上的细胞不仅形态良好，且能够很好地分散在膜上各处，说明共混膜能够很好地支持细胞的生长。

FLU值的大小反应了活细胞的数量，如图8所示。从图8可以看出，L929细胞在共混膜上的增殖较好，在第5d和第7d时，略好于纯丝素膜。经统计分析可知，两者没有显著性差异。

图8 L929细胞在不同材料上培养不同天数的FLU值Fig.8 Fluorescence value of L929 cells cultured different days on different silk fibroin membranes

由上可知，共混膜在黏附率和细胞增殖上与纯丝素膜均没有显著性差异，但又略优于纯丝素膜。另外，共混膜在乙二醇质量分数为10%时即不溶于水，且柔软性明显优于纯丝素膜，在生物材料上的应用更加广泛。

4 结论

1)乙二醇/丝素共混膜的丝素溶失率小于2%，具有较高的强度与较好的断裂伸长率，在干湿态下的透光率都超过90%，满足角膜修复材料的要求。

2)乙二醇/丝素共混膜的主要结晶结构为SilkI，在tris缓冲溶液中几乎不降解，在蛋白酶中降解性较好。

3)乙二醇/丝素共混膜，能够很好地支持成纤维细胞在其上的黏附与增殖，细胞相容性良好。

［1］VEPARI C，KAPLAN D L.Silk as a biomaterial［J］.Progress in Polymer Science，2007，32(8):991-1007.

［2］WENK E，MERKLE H P，MEINEL L.Silk fibroin as a vehicle fordrugdeliveryapplications［J］. Journalof Controlled Release，2011，150(2):128-141.

［3］HARDY J G，SCHEIBEL T R.Composite materials based on silk proteins［J］.Progress in Polymer Science，2010，35(9):1093-1115.

［4］LV Q，HU X，WANG X，et al.Water-insoluble silk films with silk I structure［J］.Acta Biomaterialia，2010，6(4):1380-1387.

［5］UNGER R E，WOLF M，PETERS K，et al.Growth of human cells on a non-woven silk fibroin net:a potential for use in tissue engineering［J］.Biomaterials，2004，25(6):1069-1075.

［6］MADDEN P W，LAI J N X，GEORGE K A，et al.Human corneal endothelial cell growth on a silk fibroin membrane［J］.Biomaterials，2011，32(17):4076-4084.

［7］LAWRENCE B D，MARCHANT J K，PINDRUS M A，et al.Silk film biomaterials for cornea tissue engineering［J］.Biomaterials，2009，30(7):1299-1308.

［8］KWEON H，HA H C，UM I C，et al.Physical properties of silk fibroin/chitosan blend films［J］.Journal of Applied Polymer Science，2001，80(7):928-934.

［9］SHE Z，ZHANG B，JIN C，et al.Preparation and in vitro degradation of porous three-dimensional silk fibroin/chitosan scaffold［J］.Polymer Degradation and Stability，2008，93(7):1316-1322.

［10］罗敏清，张岑岑，毛丽，等.水不溶性透明丝素蛋白膜的制备及性能［J］.高分子材料科学与工程，2011，27(8):141-145.LUO Minqing，ZHANG Cencen，MAO Li，et al.Preparation of transparent water-insoluble silk fibroin films［J］.Polymer Materials Science and Engineering，2011，27(8):141-145.

［11］刘宇清，于伟东，孙东豪.聚乙二醇一丝素共混膜物理性能的研究［J］.东华大学学报:自然科学版，2003，29(6):100-103.LIU Yuqing， YU Weidong， SUN Donghao. Study on physical properties of poly(ethylene glyeol)-silk fibroin polyblend membranes［J］.Journal of Donghua University:Natural Science Edition，2003，29(6):100-103.

［12］ANOOPKUMAR-DUKIE S，CAREY J B，CONERE T，et al.Resazurin assay of radiation response in cultured cells［J］.The British Institute of Radiology，2005，78(934):945-947.

［13］WEI Q N，HUANG A M，MA L，et al.Structure regulation of silk fibroin films for controlled drug release［J］.Journal of Applied Polymer Science，2012，125(S2):E477-E484.

［14］VAN DEN BERG T，TAN K.Light transmittance of the human cornea from 320 to 700 nm for different ages［J］.Vision Research，1994，34(11):1453-1456.