经皮自体移植浓缩骨髓干细胞治疗骨不连的动物实验研究

刘亚云 杨保华 陈光连

骨不连是骨科治疗中较常见并发症，发生率大约为5%～10%［1］。重新内固定术和各种植骨术等传统治疗方法，虽可使多数骨不连获得连接。但因后期手术创伤及可能出现的并发症使之成为骨科难症。近年来，随着干细胞技术的发展，利用骨髓干细胞的分化成骨潜能，为微创治疗骨不连提供了条件［2］。通过直接在骨不连部位移植成骨母细胞，提高细胞募集阶段的质与量，加速骨折的愈合过程的实验研究，为临床治疗骨不连提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物骨不连模型的制作 选用兔龄5～6个月清洁级(二级)雌性南昌大白兔32只，体重2.5～3.2 kg，随机分为A、B两组分别为实验组(干细胞组)及对照组(内固定植骨术)。全麻后，无菌操作下在“切除截骨骨不连模型”的基础上改进，制作一侧桡骨骨损1.0 cm(包骨膜)骨不连模型。

1.2 兔桡骨骨不连治疗实验

1.2.1 干细胞组 经X线检查确定骨缺损模型成功。兔子无菌麻醉下，用含抗凝剂(肝素)无菌注射器，于髂后嵴隆起处刺入髂骨达骨松质，抽吸骨髓，在同一深度抽取最大量骨髓(l ml)后。更换穿刺点继续抽吸，但两个穿刺点必须有1 cm左右的间隔，共抽吸约6 ml骨髓液。这些骨髓抽吸液在细胞分离器下离心5 min获取一浓缩的淡黄层约1 ml(即1000 /cm3以上母细胞外和一些单核细胞等)。将制作好的自体浓缩骨髓母细胞，用5 ml注射器在透视下注射到骨不连断端处约4 mm深，针尖轻轻剥离，创造容纳空间，将骨髓缓慢注入。取出时边退边做轻度的前后抽动，使穿刺通道被周围组织充填，同时以棉签压迫进针处10 min，未见明显液体流出。

1.2.2 内固定植骨术组 兔子无菌麻醉下，经手术切开暴露骨折端，咬除局部骨痂及两端的硬化骨，打通髓腔，应用钢板固定，从自身髂骨取松质骨适量，制成颗粒骨植于骨折端周围。

1.3 观察指标 ①观察术后兔的活动及伤口愈合情况;②分别于术后8、12周，每组每次随机选取8只兔麻醉后拍摄前后位及侧位X线片(投照统一条件为电压40kV、电流50 mA、曝光时间0．2s、距离为60 cm)。然后耳缘静脉注入空气处死，先肉眼观察骨痂生长情况，再行HE染色组织学观察，参照Lane-Sandhu X线评分标准及组织学评分标准，对各组骨不连愈合情况进行评分。

1.4 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件，两组间计量资料用(±s)表示，比较采用t检验。设定P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般观察结果 大体观察所有动物都能耐受麻醉和手术，术后动物无1例死亡。术后第l天进食较少，活动也少。第2天开始基本恢复正常，手术切口无红肿及渗液等，一期愈合，皮肤缝线自行脱落。

2.2 放射学检查 A组术后8周骨不连间隙基本消失，连续骨小梁存在并已通过骨不连间隙;术后12周骨痂已基本完成骨化，骨外形接近正常骨形态，部分髓腔再通，靠近尺骨部分密度尤其高。B组术后8周骨痂多且呈梭型包绕骨不连间隙，贴近钢板侧的骨不连先愈合，骨髓腔基本通畅，但骨纹理较乱;术后12周骨不连间隙骨性连接，骨纹理出现较规律的纵向排列，髓腔再通。12周A、B组骨不连愈合的Lane-Sandhu放射学评分分别为(10.27±1.10)、(9.96±0.83)分，两组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 组织学切片观察结果 第8周A组可见大量编织骨样组织，可见软骨及骨演化交接区，可见较多成骨细胞，排列较整齐，部分哈弗氏管重建，骨结构接近正常形态，局部仍可见软骨细胞集落样增生，仍可见骨质未全部连接，局部有纤维组织;B组成熟骨组织较多，有少许软骨基质填充。第12周A组骨缺损完全修复，成熟骨小梁形成，骨髓腔已贯通，哈佛氏系统形成，骨小梁排列正常，结构完全恢复;B组可见大量编织骨样组织，骨形态有序，可见大量成骨细胞，肉芽组织较少。两组Lane-Sandhu组织学标准评分比较见表1。

表1 两组Lane-Sandhu组织学标准评分比较(分，±s)

表1 两组Lane-Sandhu组织学标准评分比较(分，±s)

注:各组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)

组别 第8周 第12周A组16 14.20±0.63 16.35±1.21 B组16 14.35±1.20 18.20±1.20 n

3 讨论

3.1 骨不连的传统治疗方法 骨折的正常愈合过程终止被称为骨不连，美国食品与药品管理(FDA)将“损伤和骨折后至少9个月，并且没有进一步愈合倾向已有3个月，称为骨不连”［3］。目前，骨不连的治疗可分为开放与闭合治疗。开放手术治愈率达90%，疗效确切，并且可以尽早恢复肢体功能，提高生活质量，因此是治疗的金标准［4］。其治疗方法包括切开植骨加内固定等，自体骨因兼有骨诱导活性和骨传导作用且携有成骨作用的骨髓细胞，因而成骨效果好。但自体骨来源有限，不能满足临床需要，特别是供骨区的疼痛、畸形无法完全避免，尤其不适用于儿童及年老体弱者。而且需切开供、受骨区的软组织，创伤大，存在取材区域受限、供区并发症多、开放植入导致组织创伤使骨折端的血运进一步破坏及需要二次取出内固定物等缺点。尤其是当骨不连部位组织条件差，不具备切开植骨条件时，治疗将更加困难。

3.2 经皮自体移植浓缩骨髓干细胞 骨不连时患者骨折断端成骨细胞数量较少且活性较低，因此有必要局部补充具有成骨能力的种子细胞［5］。移植自体骨髓干细胞能够利用其向成骨细胞分化促进骨不连的愈合。问题主要是骨髓干细胞含量过低，骨髓中间充质干细胞的数量很少。Hernigou在临床试验中发现移植的骨髓干细胞治疗骨不连的有效性与移植骨髓中母细胞的浓度、数量有关，而且提示在进行骨髓注射治疗时将母细胞浓度控制在1000/cm3以上是很有必要的。本实验通过移植浓度相对较高的骨髓干细胞治疗的16例骨不连动物均达到影像学及组织学骨折愈合标准。

本研究的结果提示两组术后8周、12周X线测定、组织病理切片均形成骨性连接，新骨形成、骨改建及骨髓成熟度指标相当，即两组效果相当。而自体骨髓移植具有以下特点:①来源丰富，无排斥反应;②操作简单、安全，大多数患者不需住院，减轻患者经济负担及心理负担;③创伤小，痛苦少，可以反复治疗;④尤其对于局部软组织条件差，不宜再次手术患者。从某种意义上讲，经皮自体移植浓缩CFU-F治疗骨不连可以替代开放的植骨术，或者是开放植骨术后出现骨折延迟愈合及不愈合时的补充治疗措施。

［1］ 常玉立，孙天胜．骨不连的研究现状及展望．中国康复理论与实践，2007(13):450-453.

［2］ 王廷华，李力燕，Mcdonald JM．干细胞理论与技术．第2版．北京:科学出版社，2009:56-61.

［3］ T Can ale．坎贝尔骨科手术学．王岩，主译．第11版．北京:人民军医出版社，2009:2768-2783.

［4］ 常玉立，刘智，孙天胜．骨不连及其干细胞移植疗法的研究进展．感染、炎症、修复，2007，8(3):182-185.

［5］ 孙志波，杨述华，禹志宏，等．腺病毒介导的骨形态发生蛋白基因转移促进人间充质干细胞成骨化．郧阳医学院学报，2008，27(3):199-201.