不同保存温度对布氏菌病活疫苗(S2株）细菌存活的影响

张读朴，彭飞，乌斯满江，黄炯,2，张玉红，刘淑梅，赵海源，王洪巧

（新疆天康畜牧生物技术股份有限公司 新疆乌鲁木齐 830032；2 新疆畜牧科学院兽医研究所 新疆乌鲁木齐 830000）

不同保存温度对布氏菌病活疫苗(S2株）细菌存活的影响

张读朴1，彭飞1，乌斯满江1，黄炯1,2，张玉红1，刘淑梅1，赵海源1，王洪巧1

（新疆天康畜牧生物技术股份有限公司 新疆乌鲁木齐 830032；2 新疆畜牧科学院兽医研究所 新疆乌鲁木齐 830000）

《中华人民共和国兽用生物制品规程》规定布氏菌病活疫苗贮藏条件为2℃～8℃，有效期为一年。但在疫苗检验过程中，发现保存在2℃～8℃条件下的布氏菌病活疫苗活菌数下降的幅度较大，造成活菌数时有不达标的情况。为了保证疫苗在一年有效期内的活菌数量，常常采用增大附加量（计算头份时一般不少于30%的附加量）或低温冷冻条件保存（-15℃以下）的方法。考虑到疫苗的安全性和成本，增大附加量并不是可采用的好方法，低温存放却易于做到。为了验证2℃～8℃保存和-15℃以下低温冷冻保存的效果，本研究对比了3批布氏菌病活疫苗（S2株）在不同温度条件保存对细菌存活的影响。

一、材料与方法

1.疫苗。本公司生产的布氏菌病活疫苗（S2株），批号分别为2010004批、2012006批和2012007批。

2.培养基。胰蛋白眎琼脂平板、蛋白胨水。

3.试验方法。以保存1月为周期，每批取2℃～8℃和-15℃保存的疫苗各3瓶，每瓶加适量蛋白胨水充分溶解均匀，然后用蛋白胨水10倍系列稀释至10-9，取0.1ml滴胰蛋白眎琼脂平板3个，37℃培养72～96 h数平板上的菌落数，3个平板上菌落数相加除以3乘以疫苗瓶加量（ml）即为每瓶活菌数（CFU）。3瓶活菌数（CFU）平均即为当月保存后的细菌活菌数（CFU）。疫苗刚生产出活菌计数所得活菌数（CFU）即0个月为计算活菌率的基数，计算细菌存活率。

4.统计分析。使用统计学分析软件Prism 5.0，对同一批次不同保存温度布氏菌病活疫苗（S2株）的菌存率进行配对数据的t检验，对同一保存温度不同批次布氏菌病活疫苗（S2株）的菌存率进行单因素方差分析和Tukey's 多重比较。

二、结果

1.实验结果。通过对3批布氏菌病活疫苗（S2株）分别保存在2℃～8℃和-15℃的疫苗1年12次的活菌计数检测，显示在2℃～8℃条件下保存的疫苗，3批疫苗从第3个月起，活细菌数均明显下降，存活率在57.9～69.6%之间；至第12个月时存活率已经降至约36.37～48.18%之间。在-15℃以下条件保存的疫苗，在12个月的检测过程中，只有2010004批细菌存活率最低，为60.29%，2012006批在80%以上，2012007批在75%以上。各批细菌活菌计数结果见表略，存活率变化情况见图1。

2.统计分析结果。使用统计学分析软件Prism 5.0，对同一批次不同保存温度布氏菌病活疫苗（S2株）的菌存率，以及对同一保存温度不同批次疫苗的菌存率进行统计分析。

三、讨论

由计数结果和折线图可见，2℃～8℃和-15℃保存的3批布氏菌病活疫苗（S2株），活菌率后者均明显优于前者。2010004批疫苗保存1年后菌存率2～8℃为36.27%，-15℃为60.29%，2℃～8℃与-15℃保存的活菌率差异性极显著（P ＜0.01），且后者比前者高24.02%；2012006批疫苗保存1年后菌存率2℃～8℃为44.63%，-15℃为84.36%，2℃～8℃与-15℃保存的活菌率差异性极显著（P＜0.01），且后者比前者高39.73%；2012007批疫苗保存1年后菌存率2℃～8℃为48.18%，-15℃为89.63%，2℃～8℃与-15℃保存的活菌率差异性极显著（P＜0.01），且后者比前者高41.45%。通过对比分析显示，三批布氏菌病活疫苗（S2株）的活菌率2℃～8℃保存的与-15℃保存的活菌率差异性极显著（P ＜0.01）。

2012006、2012007两 批疫苗在1年的菌存率检测中均比2010004批疫苗高，其中，2010004批疫苗2℃～8℃保存的菌存率与2012006批疫苗差异性显著（P＜ 0.05），与 2012007批疫苗差异性极显著（P＜0.01）；2010004批疫苗-15℃保存的菌存率与2012006、2012007批疫苗均差异性极显著（P＜0.01）。出现这种情况，可能是制造疫苗的批间差异，前两批疫苗的菌液收获时机比较合适，细菌处于生长的对数期或稳定前期阶段，细菌比较健壮（幼龄和老龄都极易死亡）。掌握好菌液收获时间很重要，既要收获的细菌活力好，又要活菌数高。在生物制品生产过程中，一般在对数生长期收获菌液。细菌的形态、革兰氏染色反应应以对数生长期到静止期中期的细菌为标准。

有文章报道，布鲁氏菌病活疫苗（S2株）在2℃～8℃保存一年活菌率为78.5～82.3%。 布鲁氏菌病活疫苗（S19株）保存一年活菌率为82.54～82.64%。本次试验证实布氏菌病活疫苗（S2株）在2℃～8℃保存一年活菌率仅为36.27%～48.18%，远低于报道的78.5～82.3%的水平。

以往通气生产布氏菌病活疫苗的收获菌液活菌数只有几百亿CFU/ml，个别的能达到1000亿CFU以上/ml，牛种更低一些。随着技术的进步，设备装备水平的提高，培养基质量的改进，生产人员经验的积累，反应罐布氏菌病活疫苗（S2株）菌液通气生产细菌增殖水平显著提高，据笔者粗略统计，本公司2010年度生产的37批布氏菌病活疫苗（S2株）菌液活菌数平均为717亿CFU/ml；2011年度49批活菌数平均为1328亿CFU/ml；2012年度9批活菌数平均为1164亿CFU/ml。细菌生长的好，繁殖的快有时也会死亡的快，笔者在做牛出败疫苗检验时，发现培养菌种的培养基中添加血清时，细菌生长的好，活菌数也很高，但存放一定时间后细菌死亡的很快。布氏菌病活疫苗（S2株）是否也有这方面的原因，还需证实。

图1 三批布氏菌病活疫苗（S2株）不同保存温度菌存率

表2 同一批次不同保存温度布氏菌病活疫苗（S2株）菌存率的比较分析

表3 同一保存温度不同批次布氏菌病活疫苗（S2株）菌存率的比较分析

影响疫苗质量的因素很多，如细菌种子的质量、培养基的质量、培养温度、菌液培养时加糖量的多少、通气量的大小、培养过程PH值的变化、菌液收获时间、菌液存放时间、保护剂质量、冻干曲线等，哪个环节有问题都会对产品造成影响。各个工序都应该认真研究总结，探索最佳条件，以期生产出质量过硬的产品。

根据细菌存活的生物学特性，低温可以延缓微生物死亡，例如牛瘟兔化弱毒疫苗的新鲜淋脾毒在0℃～4℃只能保存14 d，而在-10℃～-15℃就可保存3个月；猪瘟兔化弱毒疫苗的新鲜脾淋在0℃～4℃只能保存14 d，而在-15℃则可保存6个月。本次研究结果也证实：-15℃保存明显优于2℃～8℃保存，-15℃保存对保证产品质量起着非常重要的作用，建议修改布氏菌病活疫苗贮藏的规定，将2℃～8℃贮藏调整为-15℃以下贮藏。

（略）