水酶法提取橡胶籽油的工艺研究

祖亭月 何美莹 张连富

(江南大学食品学院1，无锡 214122)

(云南省热带作物科学研究所2，景洪 666100)

橡胶籽(Rubber seed)是橡胶种植业的副产品，种仁含油率高达50%，且橡胶籽油中不饱和脂肪酸含量很高，因此橡胶籽是一种优质的油料资源。我国现有橡胶种植面积约49.3万 hm2，主要分布在海南和云南两省。据估计，我国橡胶籽年产量可达80万吨，预计可生产橡胶籽油35万吨［1］。橡胶籽油有着悠久的食用历史，我国对橡胶籽油的利用始于20世纪50年代后期，当时国内生活资料十分匮乏，食用油更是短缺。植胶农场就开始了用橡胶子油作为食用油的利用实践。与此同时，华南热带作物研究院、云南省热带作物科学研究所、昆明医学院、海南医学院等科研院所也加快了对橡胶种子油的成分、安全性、功能性等方面的研究，取得了60余项成果(含论文成果)。研究结果表明，精炼的橡胶籽油不但可以食用，还可以降低血脂胆固醇，对治疗和预防动脉硬化及心血管系统疾病有明显的疗效［2－3］。

水酶法提油工艺是一种新兴的提油方法，它通过机械和酶解来降解植物的细胞壁，使细胞中的油脂释放出来［4］。水酶法提油与传统工艺相比，有如下优点:能够保证较高的游离油得率，得到无有机溶剂残留的可以直接食用的油;处理条件温和，所提取的油纯度高，色泽浅，酸值及过氧化值低;蛋白质变性程度小，有利于残渣中蛋白质的综合利用;与溶剂浸提法相比，水酶法提油所产生的废水BOD和COD下降30% ～40%，有利于环境保护和油脂工业的可持续发展［5］。目前，水酶法已广泛应用于芝麻油、大豆油、玉米胚芽油、花生油等的提取［6－9］，但是未见在橡胶籽油提取方面的利用。鉴于橡胶籽油的高产量，研究水酶法在橡胶籽油提取方面的应用是很有价值的。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

橡胶种子:云南热带作物研究所提供;柠檬酸、磷酸氢二钠(分析纯):国药集团化学试剂公司;果胶酶、水解蛋白酶、多聚半乳糖醛酸酶、纤维素酶、中性蛋白酶、复合植物水解酶、β－葡聚糖酶:诺维信公司;山梨醇单月桂酸酯(司盘－20)、聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯(吐温－60)(分析纯):国药集团化学试剂公司。

1.2 仪器与设备

SXJQ－1型数显直流无极调速搅拌器:郑州长城科工贸有限公司;控温水浴锅:江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;DELTA 320 pH计:梅特勒－托利多仪器(上海)有限公司;EBA20离心机:德国Hettich公司;600克摇摆式高速中药粉碎机:温岭市林大机械有限公司;GC－2010气象色谱仪:日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 橡胶籽基本成分的测定

水分测定:GB/T 5009.3—2003直接干燥法;粗蛋白测定:GB/T 5009.5—2003凯式定氮法;粗脂肪测定:GB/T 5512—2008索氏提取法;粗纤维含量的测定:GB/T 5009.10—2003酸性洗涤法;灰分含量的测定:GB/T 2009.4—2003重量法;氰化物测定:GB/T 5009.36—2003粮食卫生标准的分析方法。

1.3.2 橡胶籽油提取工艺流程和提取率计算公式

式中:A为游离油Ⅰ的质量/g;B为橡胶籽的质量/g;ω为橡胶籽中油的质量分数/%;C为游离油Ⅱ的质量/g。

1.3.3 橡胶籽的破碎

采用中药粉碎机在25 000 r/min的转速下对橡胶籽进行破碎，每次破碎时间为4 s，分别破碎1～5次，得到不同粒径分布的橡胶籽粉末。根据游离油Ⅰ得率和总游离油得率考察不同粒径对游离油得率的影响。

1.3.4 酶制剂与酶解工艺参数的研究

取50 g破碎后的橡胶籽，依照1.3.2工艺，加入原料4倍的缓冲液，调节适宜的pH和温度，加入料液总质量0.5%的酶，酶解反应4 h，80℃灭酶10 min，5 000 r/min离心30 min，分别计算游离油Ⅰ得率和总游离油得率，根据提取率筛选出最佳酶制剂。由于使用单一酶的酶解效果往往较差，因此考虑将两种酶复配使用，以提高清油的得率，方法同上，筛选出最佳组合。

在确定复合酶的种类后，研究固液比、酶解pH、酶解温度、酶解时间、酶的添加量对清油提取率和总油提取率的影响，分析不同条件对橡胶籽油水酶法提油的影响，试验重复1次。最后做4因素3水平正交试验，确定最佳的酶解工艺参数。

1.3.5 破乳方法

将乳状液在沸水浴中加热10 min，用离心机在6 000 r/min下离心15 min，得到破乳油，即游离油Ⅱ。

1.3.6 橡胶籽油的质量评定

1.3.6.1 油脂脂肪酸组成的分析

将压榨法和水酶法提取出的橡胶籽油经甲酯化后用岛津GC－2010色谱仪分析。

检测器:氢火焰离子化检测器;分析柱:PEG－20M交联石英毛细管柱20 m×0.25 mm;柱温:200℃;载气:N2。

1.3.6.2 油脂常规指标的测定

透明度、气味、滋味检验:GB/T 5525—2008;色泽检验:GB/T 22460—2008;水分及挥发物检验:GB/T 5528—1995;不溶性杂质检验:GB/T 15688—2008;酸值检验:GB/T 5530—1998;过氧化值检验:GB/T 5538—2005;氰化物检验:GB/T 5009.36—2003粮食卫生标准的分析方法。

2 结果与分析

2.1 橡胶种子成分分析

测得的脱壳橡胶籽主要成分及组成见表1。

表1 橡胶籽主要成分及组成

由表1可知，橡胶籽的粗脂肪和粗蛋白含量都很高，具有很高的利用价值。水分含量各文献报道不一［10］，与贮藏时间和干燥程度有关。

2.2 破碎次数对得率的影响

将原料进行适当的破碎，有助于细胞中油滴的释放［11］，增加游离油得率。从图1可以较直观的看出，破碎程度较高的细胞，油脂释放较容易。根据文献报道［12］，破碎有干法破碎和湿法破碎，但是由于湿法破碎容易产生乳状液，降低提取率，故本试验只采用干法破碎。不同破碎次数下游离油Ⅰ和总游离油得率的结果见图2。

图1 不同破碎程度对油脂释放的影响

图2 不同破碎次数对游离油得率的影响

从图2可以看出，随着粒径的减小，游离油得率增大。但是在粒径较大时，形成的乳状液较少，随着粒径的减小，形成的乳状液增多，这是因为溶出了更多的蛋白质，与油发生了乳化。因此选择破碎3次得到的橡胶籽粉末进行后续试验。

2.3 酶制剂对得率的影响

2.3.1 单一酶制剂对得率的影响

水酶法是用酶水解油料细胞的细胞壁、脂蛋白或脂多糖，使其中包裹的油释放出来，以提高得油率。橡胶籽仁细胞壁的主要成分是纤维素、半纤维素和果胶质，故选取可以水解这些物质的酶进行试验。本试验主要选取了果胶酶、水解蛋白酶、多聚半乳糖醛酸酶、纤维素酶、中性蛋白酶、复合植物水解酶、β－葡聚糖酶，用以上酶分别处理后，以游离油Ⅰ提取率为指标对不同酶制剂的作用效果进行比较，结果见图3。

图3 单一酶制剂对游离油得率的影响

由图3可以看出，在无酶的条件下，游离油Ⅰ得率仅为22.6%，总游离油得率也仅为25.8%。单独使用其他酶，得率有所提高，但是总体水平不高。这是因为每一种酶有其酶解的专一性，单独使用效果有限，故考虑将酶复配使用，以提高提油率。

2.3.2 复配酶制剂对得率的影响

将两种不同的酶复配后进行酶解，以得率为指标，对酶解效果进行比较，结果见图4。

图4 复配酶制剂对游离油得率的影响

由图4可以看出，将酶制剂复配可以显著提高得率。这是因为细胞壁的组成成分主要是纤维素和多糖类物质，若只用单一酶处理很难将其分解完全。其中，酶组合5得油率最高，且乳状液形成量较少，故选取这一组合为复配酶制剂组合。

试验还尝试了将3种酶复配进行比较，但是得油率未有明显提高，考虑到生产成本，故选用纤维素酶与β－葡聚糖酶作为复合酶制剂。

2.4 酶解条件对得率的影响

2.4.1 固液比对游离油得率的影响

固定反应条件为pH 4.5，酶解温度50℃，酶解时间4 h，加酶量为0.5%(每种酶单独的添加量)，研究不同固液比对游离油得率的影响，结果见图5。

图5 固液比对游离油得率的影响

由图5可以看出，开始时随液体比例的增加，游离油的得率也随之增加，至1∶4时达到最大值，随后液体再增加，油得率逐渐降低。固液比较低时，乳状液形成量较少，随着固液比增大，由于蛋白质溶出量增多，乳状液的量也增大。故选取固液比为1∶4，此时游离油得率较高，且乳状液生成量适中。

2.4.2 pH对游离油得率的影响

pH影响着酶的活性，也影响着蛋白质的溶解度。为得到较多的澄清油，尽量防止乳化的发生，有必要对不同pH的作用效果进行比较，结果见图4。其他酶解条件为温度50℃，固液比1∶4，酶解时间4 h，酶添加量为 0.5%。

图6 不同pH对游离油得率的影响

由图6可以看出，pH较低时游离油得率较低，随着pH的升高，游离油得率随之升高，至pH 5.0时达到最大，游离油得率为72.3%。还可以看出，在较低pH时，乳状液生成量较低，随pH升高，乳状液的生成量也升高，从而导致游离油得率降低。因为pH影响着蛋白质的等电点，在pH较高时，有较多的蛋白质溶解在油中，起到了表面活性剂的作用，导致较多的乳状液形成。从图6可以看出，在pH 5.0时，游离油得率最高，且乳状液生成量较低，故选取pH 5.0为最佳反应pH。

2.4.3 酶解温度对游离油得率的影响

酶解温度对于酶的活性影响很大，通常温度高时酶活性较大。纤维素酶与β－葡聚糖酶的最适温度为40～60℃。不同温度下酶解效果见图5。其他条件为:固液比1∶4，pH 5.0，酶解时间4 h，酶添加量为0.5%。

图7 温度对游离油得率的影响

由图7可以看出，游离油得率随温度升高而增大，50℃时达最大，得率为73.5%。之后温度继续升高，游离油得率下降加速，原因是温度过高，加速了酶的失活，从而减弱了酶解作用，导致游离油得率下降。乳状液的生成随温度升高而降低，这是因为高温降低了乳状液的稳定性，有助于破乳。但为了得到较高的游离油得率，选取最适酶解温度为50℃。

2.4.4 酶解时间对游离油得率的影响

酶与底物接触的时间越长，酶解得越彻底，故研究酶解时间对游离油得率的影响。其他反应条件为:固液比 1∶4，pH 5.0，温度 50 ℃，酶添加量为0.5%。结果见图 8。

图8 酶解时间对游离油得率的影响

由图8可以看出，随着酶解时间的延长，提油率缓慢增长，但是超过12 h后，游离油得率都开始下降，原因可能是油与蛋白质接触时间过长，产生了稳定的乳状液，破乳也比较困难。还可以看出，在酶解时间为8、10、12 h时，游离油得率几乎没有变化，考虑到生产成本，选择酶解时间为8 h较适合。

2.4.5 酶添加量对游离油得率的影响

选取不同的酶添加量，考察其对游离油得率的影响。其他反应条件为:固液比1∶4，反应时间4 h，反应温度50℃，pH 5.0。结果见图9。

图9 不同酶添加量对游离油得率的影响

由图9可以看出，游离油得率随酶添加量的增加而略有增加，当酶添加量增加到0.7%时，游离油得率反而降低。这可能是由于随着酶添加量的增加，油释放的速度加快，乳状液形成速度随之增加，导致游离油得率降低。同时，酶添加量增加，容易形成稳定的乳状液，导致破乳困难，使总游离油得率也略有下降。

2.4.6 酶解工艺的优化

选取固液比，酶解时间，酶添加量，酶解温度进行四因素三水平正交试验，按L9(34)设计正交表，以总游离油得率为指标，正交试验的因素水平见表2。

表2 正交试验因素水平表

按照L9(34)设计，以总游离油得率为指标进行正交试验，结果见表3。

表3 正交试验结果表

对上述结果进行方差分析，结果见表4。

表4 方差分析表

极差分析和方差分析结果表明，影响总游离油得率因素的顺序为酶解时间＞酶解温度＞酶添加量＞固液比，其中，酶解时间对结果影响显著，最佳反应组合为A1B2C3D2。但是组合A1B2C2D2与最佳组合相比，相差不大，但是反应条件比最佳组合低，考虑到生产成本，故选取组合A1B2C2D2代替最佳组合。即酶解工艺确定为固液比1∶4，酶解时间8 h，酶添加量0.5%，酶解温度50℃。

3 橡胶籽油质量评定

3.1 橡胶籽油的脂肪酸组成

将水酶法提取的橡胶籽油处理后，测定其脂肪酸组成，结果见图10a。同样方法分析压榨橡胶籽油的脂肪酸组成，结果见图10b。

图10 不同方法提取的橡胶籽油的脂肪酸气相色谱图

将图10的峰经归一化处理后得到的橡胶籽油主要脂肪酸组成见表5。可以看出，橡胶籽油不饱和脂肪酸质量分数很高，达到了84.5%，因此橡胶籽油是一种具有很好的保健作用的新的食用油。水酶法提取油与压榨法提取油的脂肪酸组成无明显差别，说明水酶法工艺对于油的品质没有破坏，进一步说明了水酶法提取橡胶籽油工艺是可行的。

表5 橡胶籽油的主要脂肪酸组成

3.2 橡胶籽油的理化指标

由于橡胶籽油是一种新型食用油，目前还没有国标来评定其等级。将橡胶籽与几种常见的油料原料进行比较，橡胶籽与葵花籽组成最为接近，故选用葵花籽油的国家标准作为橡胶籽油质量评定的依据，结果见表6。

表6 橡胶籽油质量评定

将水酶法和压榨法得到的橡胶籽油分别进行了氰化物的定性检测，水酶法提取的橡胶籽油未检出氰化物，但是压榨法提取的橡胶籽油检出了氰化物。因此，采用水酶法提取的橡胶籽油无需进一步进行氰化物的脱除，从而简化了制取工艺。

由表6可以看出，用水酶法得到的橡胶籽油除酸值偏高外，其余均符合国家标准。酸值偏高的原因一方面是因为原料贮存较久，另一方面是因为水酶法提取工艺是在较低的pH下进行的，pH约为5.0，导致游离油的酸值偏高。而且，H+可以作为油脂水解的催化剂，促使油脂发生水解反应，游离脂肪酸增加，酸值也会随之增高。

水酶法提取的橡胶籽油，只需进行脱酸得到符合标准的成品油，比起压榨法提取工艺需要脱胶、脱酸、脱腊、脱水、脱臭、脱色等精炼步骤而简化了许多，从而使生产效率得到了提高，并且减少了污染。

4 结论

本试验通过单因素和正交试验优化了工艺参数，确定了水酶法的最佳提取工艺为固液比1∶4，酶解时间8 h，酶添加量0.5%，酶解温度50℃，pH 5.0。在5 000 r/min下离心 30 min，然后对乳状液进行加热破乳，破乳条件为沸水浴10 min，6 000 r/min下离心10 min。最后总游离油得率可达到89.3%。

采用水酶法提取的橡胶籽油，品质较好，后续所需精炼步骤简单，节约了精炼步骤所需的成本。提取率高于压榨法的提取率(约66%)，并且，水酶法的反应条件温和，蛋白质变性小，可对残渣中的蛋白质进行回收，有利于原料的综合利用。

［1］胡小泓，刘大川，张新才.橡胶籽油的制取及精炼工艺研究［J］.中国油脂，2005，30(11):65 －67

［2］潘善甫，郑联合.食用橡胶籽油的开发利用研究［J］.中国油脂，2000，25(6):114 －115

［3］何美莹，李国华，李海泉.关于云南橡胶种子油食用开发现状与思考［J］.热带农业科技，2010，33(4):36－42

［4］Dominguez H，Nunes M J，Lema J M Enzymatic pretreatment to enhance oil extraction from fruits and oilseeds:a review［J］.Food Chemistry，1994，49:271 －286

［5］谭春兰，袁永俊.水酶法在植物油脂提取中的应用［J］.食品研究与开发，2006，27(7):128 －130

［6］Latif S，Anwar F.Aqueous enzymatic sesame oil and protein extraction［J］.Food Chemistry，2011，125:679 －684

［7］Rosenthal A，Pyle D L.Combined effect of operational variables and enzyme activity on aqueous enzymatic extraction of oil and protein from soybean［J］.Enzyme and Microbial Technology，2008，28:499 －509

［8］王素梅，王璋，单晓红.玉米胚水酶法提油工艺机理探索［J］.西部粮油科技，2003(6):19 －21

［9］华娣，许时婴，王璋，等.酶法提取花生油与花生水解蛋白的研究［J］.科研开发，2006，22(6):16 －19

［10］刘石生，梁振益，陈香英.响应面法优化橡胶籽油的溶剂法提取工艺［J］.中国油脂，2010，35(2):14 －17

［11］Rosenthal A，Pyle D L，Niranjan K.Aqueous and enzymatic process for edible oil extraction ［J］.Enzyme and Microbial Technology，1996，19:402 －420

［12］刘倩茹，赵光远，王瑛瑶，等.水酶法提取油茶籽油的工艺研究［J］.中国粮油学报，2011，26(8):36 －40.