碱性蛋白酶水解对豆粕中大豆抗原蛋白的影响

王章存 李乐静 赵学伟 崔胜文 胡金强 王吉中

(郑州轻工业学院食品与生物工程学院，郑州 450002)

豆粕是大豆低温浸出制油后的副产品，含蛋白质达45%以上，在食品工业和动物饲料生产中具有重要作用。但大豆也是公认的八大食物过敏源之一，豆粕中主要蛋白质成分——7S和11S球蛋白也是主要的抗原蛋白，它们对热稳定，一般加热方法不能消除其抗原性［1］。若过度加热将导致这些蛋白质变性，影响其消化利用率。研究表明，大豆蛋白的抗原性源于它们的亚基组成，7S中的β－伴大豆球蛋白是分子质量为140～180 ku的糖蛋白，它是由α、α'和β三种亚基按一定方式组合而成的三聚体［2－3］，其中α和α'亚基的抗原性最强［4］。11S球蛋白是分子质量为300～380 ku的六聚体复合物，由6个酸性(A)亚基和6个碱性(B)亚基组成，其中酸性亚基可以引起人体和动物的过敏反应［5］。这些蛋白质的大分子结构及其形成的抗原决定族是它们表现抗原性的重要基础［6］。酶解方法则可降解大豆蛋白分子，破坏大豆抗原蛋白的结构和抗原决定族。据报道，大豆11S球蛋白经胃蛋白酶水解为20 ku小分子后即可失去抗原活性［7］，用大豆分离蛋白的酶解结果也支持这一结论［8］。然而，尽管目前关于大豆蛋白酶解的报道很多，但有关酶解过程中大豆蛋白分子组成变化的研究较少，以豆粕为原料的研究更少。本研究选用Alcalase蛋白酶对此进行研究，为探讨有效消除豆粕中抗原蛋白的酶解方法提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

低温脱脂豆粕:山东嘉华油脂有限公司;碱性蛋白酶(Alcalase 2.4 AU/g):诺维信公司;巯基乙醇(ME)、十二烷基硫酸钠(SDS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris):Sigma公司;N，N，N'，N'－四甲基乙二胺(TEMED):FLUKA 公司;丙烯酰胺(Acr)、N，N'－亚甲基双丙烯酰胺(Bis):Amresco公司;考马斯亮兰R250(FLUKA公司);低分子质量标准蛋白(Mr.14 400～97 400，上海生物化学研究所;其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

DYY－7C型电泳仪、DYCZ－24DN型电泳槽:北京六一仪器厂;UV－8100 B紫外可见分光光度计:北京LabTech莱伯泰科仪器公司。

1.3 方法

1.3.1 低温脱脂豆粕的酶解

取粉碎过60目的豆粕样品加水配制成8%的溶液，加热至55℃后用1 mol/L NaOH调至pH 8.0，然后按酶/蛋白质比例为1∶100加入碱性蛋白酶。反应开始后，滴加 NaOH溶液维持pH恒定，并记录消耗NaOH体积。反应到预定时间后，将反应液在沸水浴中加热10 min灭酶，1 500 r/min离心10 min，沉淀部分用2倍体积水洗涤2次，合并上清液并冷冻干燥。

1.3.2 蛋白质的溶解性测定

双缩脲法测定可溶性蛋白质含量，与酶解液中总蛋白质含量的百分比值，即为蛋白质的溶解性。

1.3.3 水解度(DH)的测定

采用pH－stat法。

1.3.4 酶解物在三氯乙酸中的溶解性测定

取冻干的可溶性酶解样品0.5 g，加入35℃预热的10%三氯乙酸(TCA)溶液20 mL，振摇10 min后，1 500 r/min离心10 min。双缩脲法测定上清液中蛋白质含量，计算其与样品中蛋白含量比值。

1.3.5 SDS－PAGE 分析

采用 Laemmli系统［9－10］。电泳条件:浓缩胶和分离胶浓度分别为5%和12%，初始电压为80 V，分离时改用110 V。采用低分子质量的标准蛋白，考马斯亮蓝R－250染色。水不溶性样品和TCA不溶性样品先用pH 10.0 NaOH溶液溶解，TCA可溶性蛋白溶液先调至pH 8.0后再进行SDS－PAGE分析。

1.3.6 数据处理

采用Gel－Pro Analyzer软件定量分析了SDSPAGE图谱。

2 结果与分析

2.1 酶解时间对大豆蛋白溶解性和水解度的影响

不同酶解时间条件下大豆蛋白质溶解性和水解度(DH)测定结果如图1所示。酶解10 min时蛋白质的溶解性由未酶解时的62.3%快速增加到87.19%，但其后随着酶解时间的延长，其溶解性的增加并不显著，说明豆粕中的蛋白质易被Alzalase酶解而溶解。

水解度也随酶解时间的延长而增加。但大豆蛋白水解度与其溶解性的变化幅度并不同步，如酶解10 min时，溶解性已达到较高水平(87.19%)，而水解度仅为 4.8%;酶解 60 min时，溶解性增加到95.1%。而水解度则增加到6.9%(提高约 50%)。这说明，那些因酶解而呈溶解状态的大豆蛋白或肽分子在溶液中继续被酶水解。

图1 酶解时间对豆粕蛋白溶解率和水解度的影响

2.2 酶解时间对TCA可溶性酶解物含量的影响

三氯乙酸(TCA)可以使蛋白质大分子变性沉淀，而小分子蛋白质或肽则不易沉淀。在营养学上，蛋白质酶解物在TCA中的溶解性往往是评价该产物是否符合小分子活性肽的重要指标之一。本试验分析了不同时间酶解物在TCA中溶解性的变化(图2)，可以看出，随着酶解时间的延长，可溶于TCA的蛋白质/肽分子的比例越来越高，意味着大豆蛋白质分子的降解较多。

图2 不同时间酶解物在TCA中的溶解性

2.3 酶解过程中大豆蛋白分子亚基的变化

2.3.1 酶解后水可溶性蛋白质成分的变化

用SDS－PAGE方法分析了不同酶解时间条件下豆粕中蛋白组分及其含量变化(图3)，可以看出，在未酶解的豆粕中，可溶性的酶解物有多种蛋白质组分。酶解10 min时，7S中的α'、α和β三个亚基已完全消失，11S中的38 ku酸性亚基和21 ku碱性亚基含量也明显减少，与此同时，新产生了23 ku(箭头a)和大量的分子质量小于14 ku组分。60 min时，38 ku亚基完全消失，90 min时，21 ku亚基几乎完全消失，且23 ku组分含量也开始减少，同时，分子质量小于14 ku组分的含量明显增加。而整个酶解过程中，15 ku碱性组分始终没有被酶解的迹象。这些结果表明，豆粕中的7S抗原蛋白很容易被Alcalase酶水解，而11S球蛋白的碱性亚基对该酶的敏感程度较弱。对于11S球蛋白酸性亚基先于碱性亚基被酶水解的解释是，碱性亚基含有相对较多的疏水性氨基酸，在形成高级结构时它们位于11S球蛋白分子的内部，而酸性亚基则位于球形的外部［6，11］。

图3 酶解豆粕可溶性成分的SDS－PAGE

2.3.2 酶解后豆粕残余物中蛋白质成分的变化

为了较全面了解酶解豆粕中蛋白质分子变化情况，按照司晓霞等［10］的方法对酶解离心后不溶于水的豆粕残余物的蛋白进行提取并做SDS－PAGE分析(图4)，这也是目前研究中常被回避的重要问题。可以看出，酶解10 min时，豆粕中已经不存在α'、α亚基，11S中的酸性组分含量也大大减少，酶解60 min时已全部消失。但属于7S伴球蛋白的β亚基、11S的B3碱性亚基的含量反而有增加的趋势，可能是酶解7S和11S蛋白质分子中的α＇、α亚基和A3酸性亚基后，导致不太易水解的β亚基和B3碱性亚基含量相对增加。也可能是酶解后豆粕中这些亚基是以某种聚集体形式存在但不溶于水，当电泳分析时由于巯基乙醇处理后溶解，从而在电泳谱带中显示含量增加。

文献中对高纯度大豆分离蛋白的酶解研究认为，当大豆蛋白降解为分子质量小于20 ku后，其抗原性消失［7－8］，国外大豆水解蛋白婴儿奶粉中的分子质量一般小于28 ku且被认为是安全的［12］。本试验研究显示，虽然在水不溶性酶解豆粕中仍有分子质量为20～52 ku的组分，但由于这部分酶解豆粕所占比例只有约5%(图1)，因此整个酶解豆粕的饲用安全性得到明显改善。

图4 酶解豆粕残余物中蛋白质SDS－PAGE

2.4 TCA溶解性蛋白质的分子特征

为进一步了解酶解豆粕在TCA中溶解与蛋白质分子特征之间的关系，用SDS－PAGE分析了TCA可溶性组分及不溶性组分(图5)。可以看出，未酶解豆粕中尽管有60%以上(图1)蛋白质可溶于水，但可溶于TCA中的成分极少(14.4 ku和8 ku，图5a)，绝大多数成分不能溶于TCA(图5b)。而酶解后溶于TCA中的成分很多(几乎全部是20 ku以下的小分子)，由于这些组分是酶解后生成的小肽分子，它们分子质量的差别不足以在电泳中拉开距离，因而谱带不清晰(利用tricine－SDS－PAGE也无法将其分离清晰)。值得注意的是，仍有一些小分子(如17 u、10 ku)组分也不能溶于TCA。这些结果也表明，文献中以是否在TCA中溶解来直接判断分子大小的做法并不适合于大豆蛋白酶解物的评价。

图5 TCA可溶蛋白和不溶蛋白的SDS－PAGE图谱

3 结论

豆粕因其抗原蛋白的存在大大限制了其在幼小动物饲料中的使用量。本研究表明，碱性蛋白酶不仅有效改善豆粕中大豆蛋白的溶解性能，也快速将绝大部分大豆抗原蛋白降解为21 ku以下的肽，大大改善豆粕的饲用安全性。

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