“长林”系列油茶籽中非油类主要功能性成分比较

李海琳 刘京晶 斯金平 吴令上 冯 瓅 杨晓梅

(浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地天然药物研发中心，临安 311300)

油茶(Camellia oleifera Abel.)为我国特有的木本油料树种，具有很高的食药用价值。茶籽油富含不饱和脂肪酸，营养价值高，有“东方橄榄油”之称［1］。此外，油茶籽榨油后的饼粕中含有丰富的三萜皂苷、黄酮、多糖和蛋白质等功能性成分，极具开发利用前景:皂苷具有抗炎、抗过敏、抗肝毒、降血压等药用价值［2］;黄酮类化合物具有抗氧化、抗心脑血管疾病等多种生理功能［3］;茶籽多糖具有抗血栓、降血糖、修复糖代谢紊乱、调节免疫以及抗氧化等活性［4－5］;茶籽蛋白中含有17种氨基酸，其中8种是人体必需的氨基酸［6－7］，可以作为生产蛋白饮料、焙烤食品等的蛋白质强化剂，经酶解还可制备功能性多肽［8］。目前，油茶产区正在大规模推广种植“长林”系列油茶新品种，本研究主要通过对“长林”系列10个品种油茶籽种仁中总三萜、总黄酮、总多糖和总蛋白4种非油类功能性成分的含量进行测定和分析，为油茶籽的综合利用、油茶新品种选育以及相关功能性食品或药品的开发提供科学依据。

1 材料

1.1 试剂与仪器

芦丁、D－葡萄糖、齐墩果酸、牛血清蛋白对照品:中国药品生物制品检定所;Lowry法蛋白含量测定试剂盒:上海荔达生物技术有限公司;香兰素:天津市永大化学试剂有限公司;苯酚:北京索莱宝科技有限公司;亚硝酸钠、硝酸铝:上海振欣试剂厂;氢氧化钠:西陇化工股份有限公司;冰乙酸、无水乙醇、浓硫酸均为分析纯:天津市永大化学试剂有限公司。

UV 2500紫外－可见分光光度计:上海第三分析仪器厂;DK－S24型电热恒温水浴锅:上海森信实验仪器有限公司;AB104－N电子分析天平:梅特勒托利多仪器上海有限公司;SWB5200型超声波清洗仪:上海必能信超声有限公司;D－37520型高速离心机:德国HERAEUS公司;RE－121旋转蒸发仪:瑞士步琪公司。

1.2 供试样品

“长林”系列10个品种油茶种籽均于2011年10月份采自浙江省丽水市油茶种质资源库，剥除果皮和种壳，种仁于60℃干燥箱中烘干，粉碎过10目筛，干燥器中保存。除长林180号外，其余均已通过国家或省级良种审定［9］(表1)。

2 方法

2.1 总三萜的含量测定

2.1.1 供试品溶液的制备

取油茶籽种仁粉末 0.5 g，精密称定，置于100 mL圆底烧瓶中，加入甲醇25 mL，80℃水浴回流提取1 h，过滤、将滤液定容至250 mL容量瓶中，摇匀，即得。

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的齐墩果酸对照品2 mg，置于10 mL容量瓶内，加入甲醇定容至刻度，配制成0.2 mg/mL的对照品溶液，置冰箱中备用。

表1 “长林”系列油茶品种基本情况

2.1.3 标准曲线的绘制

精密吸取对照品溶液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL分别至试管中，加甲醇补足至1 mL，100℃水浴蒸干后，分别加入5%香草醛 －冰醋酸溶液0.5 mL，摇匀，加入高氯酸溶液0.8 mL，60℃水浴20 min，取出后于冰水浴中加入冰乙酸5 mL，摇匀，室温放置15 min。以甲醇溶液为空白对照，同法操作，在550 nm波长处测定吸光度值。以浓度(x)为横坐标，吸光度值(y)为纵坐标绘制标准曲线，结果总三萜的标准曲线方程为 y=7.587 5x －0.002 8，r=0.999 2(n=5)，线性范围为0.02 ～0.16 mg。

2.1.4 显色稳定性试验

取同一供试品溶液，按2.1.3操作，每隔0.5 h测定其吸光度值，结果RSD为2.62%(n=5)，表明供试品溶液在显色后2 h内稳定。

2.1.5 精密度试验

精密吸取对照品溶液6份，各1 mL，按2.1.3连续测定，结果RSD为1.62%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性试验

按2.1.1平行制备6份供试品溶液，分别测定其吸光度值，结果RSD为4.38%，表明方法重复性良好。

2.1.7 加样回收率试验

精密称取已知含量的同一供试品6份各0.25 g，分别加入适量齐墩果酸对照品溶液，按2.1.1制成供试品溶液，按2.1.3测定吸光度值，计算回收率为99.3% ～104.1%，RSD 为1.63%。

2.1.8 样品含量测定

样品按2.1.1制成供试品溶液，平行3份，精密吸取1 mL至试管中，按2.1.3测定吸光度值，计算其含量。

2.2 总黄酮的含量测定

2.2.1 供试品溶液的制备

取油茶籽种仁粉末1.0 g，精密称定，置于100 mL圆底烧瓶中，加入80%甲醇50 mL，80℃水浴回流提取1 h，过滤、将滤液浓缩后定容至5 mL容量瓶中，摇匀，即得。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的芦丁对照品11.1 mg置于50 mL容量瓶中，加入80%甲醇定容至刻度，配制成0.222 mg/mL的对照品溶液，置冰箱中备用。

2.2.3 标准曲线的绘制

精密吸取对照品溶液 1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL分别置于25 mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min;加1%硝酸铝溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min;加4%氢氧化钠溶液10.0 mL，摇匀，再加80%甲醇定容至刻度，摇匀，放置15 min。以80%甲醇溶液为空白对照，同法操作，在510 nm波长处测定吸光度值［3］。以浓度(x)为横坐标，吸光度值(y)为纵坐标绘制标准曲线，结果总黄酮的标准曲线方程为 y=0.452 12x+0.000 59，r=0.999 9(n=6)，线性范围为0.222 ～2.22 mg。

2.2.4 显色稳定性试验

取同一供试品溶液，按2.2.3操作，每隔0.5 h测定其吸光值，结果RSD为2.13%(n=5)，表明供试品溶液在显色后2 h内稳定。

2.2.5 精密度试验

精密吸取对照品溶液6份，各2 mL，按2.2.3连续测定，结果RSD为2.01%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 重复性试验

按2.2.1平行制备6份供试品溶液，测定其吸光度值，结果RSD为3.13%，表明方法重复性良好。

2.2.7 加样回收率试验

精密称取已知含量的同一供试品6份各0.5 g，分别加入适量芦丁对照品溶液，按2.2.1制成供试品溶液，按 2.2.3测定吸光度值，计算回收率为97.9% ～101.2%，RSD 为1.69%。

2.2.8 样品含量测定

样品按2.2.1制成供试品溶液，平行3份，精密吸取1 mL至25 mL容量瓶中，按2.2.3测定吸光度值，计算其含量。

2.3 总多糖含量的测定

2.3.1 供试品溶液的制备

取油茶籽种仁粉末0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入石油醚100 mL，密塞超声脱脂30 min。过滤，挥干溶媒，加入80%无水乙醇100 mL，转移至圆底烧瓶中，85℃回流提取1 h，趁热过滤，挥干溶媒，加入蒸馏水100 mL，100℃回流提取2 h，趁热过滤，定容至250 mL容量瓶中，摇匀，即得。

2.3.2 对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的D－无水葡糖糖对照品10.0 mg于100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，配制成0.1 mg/mL的对照品溶液，置冰箱中备用。

2.3.3 标准曲线的绘制

精密吸取对照品溶液 0.1、0.3、0.6、0.9、1.5、1.8 mL分别至试管中，加蒸馏水补足至2 mL，摇匀后冰浴中加入5%苯酚溶液1 mL、浓硫酸溶液5 mL，同时摇匀，静置5 min，100℃水浴15 min，迅速冷却至室温。以蒸馏水为空白对照，同法操作，在490 nm波长处测定其吸光值［10］。以浓度(x)为横坐标，吸光度值(y)为纵坐标绘制标准曲线，结果总多糖的标准曲线方程为 y=13.937x －0.043 9，r=0.999 7(n=6)，线性范围为0.01 ～0.18 mg。

2.3.4 显色稳定性试验

取同一供试品溶液，按2.3.3操作，每隔0.5 h测定其吸光度值，结果RSD为2.03%(n=5)，表明供试品溶液在显色后2 h内稳定。

2.3.5 精密度试验

精密吸取对照品溶液6份，各0.9 mL，加蒸馏水补足至 2 mL，按 2.3.3连续测定，结果 RSD 为2.41%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 重复性试验

按2.3.1平行制备6份供试品溶液，测定其吸光度值，结果RSD为1.54%，表明试验重复性良好。

2.3.7 加样回收率试验

精密称取已知含量的同一供试品6份，各0.25 g，分别加入适量葡萄糖对照品溶液，按2.3.1制成供试品溶液，按2.3.3测定吸光度值，计算回收率为96.5% ～101.7%，RSD 为2.12%。

2.3.8 样品含量测定

样品按2.3.1制成供试品溶液，平行3份，精密吸取2 mL至试管中，按2.3.3测定吸光度值，计算其含量。

2.4 总蛋白含量的测定

2.4.1 供试品溶液的制备

取油茶籽种仁粉末0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入30 mL石油醚溶液，密塞超声脱脂15 min，过滤，挥干溶媒，加入蒸馏水30 mL，超声提取20 min，过滤、将滤液定容至100 mL容量瓶中，取8 mL滤液于10 mL离心管中以8 000 r/min离心15 min，取上清液，即得。

2.4.2 对照品溶液的制备

精确称取干燥至恒重的牛血清蛋白对照品6.25 mg于25 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，配成浓度为0.25 mg/mL的对照品溶液，置冰箱中备用。

2.4.3 标准曲线的绘制

精密吸取对照品溶液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至试管中，加蒸馏水补足至1 mL，摇匀。分别在试管中加入Lowry法蛋白质含量测定试剂盒中的试剂A 5 mL，摇匀，于室温放置10 min，再加入试剂B 0.5 mL，立即摇匀，于室温放置30 min。以1 mL蒸馏水作空白对照，同法操作，在750 nm波长处测定其吸光度值。以浓度为横坐标(x)，吸光度值为纵坐标(y)，绘制标准曲线，结果总蛋白的标准曲线方程为 y=2.897 3x+0.005 4，r=0.999 5(n=6)，线性范围0.025 ～0.250 mg。

2.4.4 显色稳定性试验

取同一供试品溶液，按2.4.3操作，每隔0.5 h测定其吸光度值，结果RSD为2.42%(n=5)，表明供试品溶液在显色后2 h内稳定。

2.4.5 精密度试验

精密吸取对照品溶液6份，各0.4 mL，加蒸馏水补足至 1 mL，按 2.4.3连续测定，结果 RSD为2.28%，表明仪器精密度良好。

2.4.6 重复性试验

按2.4.1平行制备6份供试品溶液，测定其吸光度值，结果RSD为3.08%，表明方法重复性良好。

2.4.7 加样回收率试验

精密称取已知含量的同一供试品6份，各0.05 g，分别加入适量牛血清蛋白对照品溶液，按2.4.1制成供试品溶液，测定吸光度值，计算回收率为101.9% ～104.8%，RSD 为 1.01%。

2.4.8 样品含量测定

样品按2.4.3制成供试品溶液，平行3份，精密吸取1 mL至试管中，按2.4.3测定吸光度值，计算其含量。

3 结果与分析

“长林”系列10个品种油茶籽种仁中总蛋白、总三萜、总多糖和总黄酮4类主要功能性成分测定结果列于表2。

表2 不同品种油茶籽种仁中总三萜、总黄酮、总多糖和总蛋白含量(n=3)

从表2可见，油茶籽种仁中总蛋白为12.96% ～17.38%，长林4号最高，长林166号、21号、18号次之(3个品种间无显著差异)，长林40号最低;总三萜为2.56% ～5.37%，长林4号最高，长林27号、53号次之，长林55号最低;总多糖为0.65% ～1.43%，长林40号最高，长林53号、27号次之，长林180号最低;总黄酮为0.53% ～1.06%，长林53号、3号最高，长林27号次之，长林21号最低。分析结果表明，各类功能性成分在品种间均存在较大的差异。

“长林”系列油茶籽种仁中4类功能性成分含量高低依次为总蛋白＞总三萜＞总多糖＞总黄酮，四者间含量无显著相关性。结合文献中其含油率进行分析(长林180号未经国家审定，缺含油率数据，未计算在内)，结果表明含油率与总三萜(R=－0.747，P ＜0.05)和总黄酮含量(R= －0.731，P ＜0.05)均呈显著负相关。

4 讨论与结论

本试验在4类功能性成分含量测定方法的建立过程中，分别考察了提取溶剂、物料比等因素。总三萜分别用50%甲醇水溶液、80%甲醇水溶液、甲醇和二氯甲烷进行回流提取，结果表明甲醇提取率最高;物料比为1/50时提取的供试品溶液吸光度值在标准曲线线性范围之内。总黄酮分别用50%甲醇水溶液、80%甲醇水溶液、甲醇进行回流和超声提取，结果表明甲醇回流提取率最高;物料比为1/50提取的供试品溶液直接测定吸光度值过低，经试验，浓缩10倍后符合标准曲线线性范围。总多糖和总蛋白的提取，考察了样品称样量和终溶液体积，分别以0.5 g/250 mL和0.1 g/100 mL制备的供试品溶液测得吸光度值符合标准曲线线性范围。紫外分光光度法操作简便稳定、测定结果可靠，可用于4类功能性成分含量的测定。

“长林”系列油茶籽种仁中均含有丰富的蛋白、三萜、多糖和黄酮类成分，这4类功能性成分含量在油茶品种间均存在较大差异，但含量之间无显著相关性。含油率与总三萜和总黄酮含量均呈显著负相关，这可能是由于种子成熟后期，脂肪酸类和淀粉(多糖类)成分迅速增加，含量上升明显，而三萜类成分基本稳定，相对种仁总重量的增加，表现为含量下降［11］。

4类功能性成分中，总蛋白和总三萜含量均以长林4号最高，总多糖含量以长林40号最高，总黄酮含量以长林53号和3号最高。因此，针对油茶不同功效产品的开发应选择相应的品种。

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