维药罗勒提取物对小鼠巨噬细胞RAW264.7生长及其胞内5-脂氧酶活性的影响

米娜瓦尔·哈帕尔， 阿孜古丽·吐尔逊， 周文婷， 程路峰， 依巴代提·吐乎提，娜迪热·热依木， 艾尼瓦尔·吾买尔*

(1.新疆医科大学基础医学院药理教研室，新疆乌鲁木齐830011;2.新疆医科大学第一附属医院细胞生物学室，新疆乌鲁木齐830011;3.新疆医科大学第二附属医院内科，新疆乌鲁木齐830063)

罗勒Ocimum basilicum L．是维吾尔医应用历史悠久的常用药材之一，是唇形科植物罗勒的地上部分，一年生草本，全国各地均有栽培。罗勒具有疏风解表、化湿和中、行气活血、强心安神、解毒消肿等功效［1-2］，主治感冒头疼、发热咳嗽、中暑等。其主含的化学成分有挥发油类、黄酮及其苷类、香豆素类，此外还含有三萜类和生物碱类等成分［3-4］。本课题组前期发现罗勒乙酸乙酯提取物对环氧合酶途径具有抑制作用［5-8］，本研究旨在检测罗勒提取物对经脂多糖刺激的RAW264.7细胞生长以及胞内5-酯氧酶活性的影响，探讨罗勒提取物对体内花生四烯酸代谢网络的另一通路——5-酯氧酶途径的可能影响。

1 材料与方法

1.1 仪器 倒置荧光显微镜 (OLYMPUS，日本);高速多功能冷冻离心机 (BR4i型，法国);生物安全柜 (Haier，中国);CO2培养箱 (Thermo，美国);全波长酶标仪 (Benchmark PLUS，德国)。

1.2 试剂与材料 小鼠腹腔巨噬细胞(RAW264.7)购于中科院上海细胞库 (中国典型培养物保藏中心CCTCC);罗勒:2010年9月采自新疆吐鲁番市托克逊县种植基地，品种由新疆医科大学药学院天药/生药学教研室帕丽达·阿不力孜教授鉴定;DMEM干粉培养基 (GIBCO公司);胎牛血清 (FBS)(GIBCO公司);四唑蓝 (MTT)(Sigma公司);吲哚美辛 (Sigma公司);脂多糖脂多糖 (Sigma公司);前列腺素 E2(PEG2)ELISA试剂盒 (GBD公司，批号:BA3248)，花生四烯酸 (Sigma公司);胰蛋白酶 (GIBCO公司);PBS缓冲液;白三烯B4ELISA试剂盒 (武汉中美科技有限公司，批号:BA2043);NDGA(Sigma公司)。

1.3 方法

1.3.1 罗勒的提取与分离 将阴干后的罗勒地上部分剪碎，称取200 g，在室温条件下用2 600 mL、75%乙醇密闭浸泡24 h后采用超声仪进行提取，用旋转蒸发仪减压浓缩回收乙醇得到乙醇提取物，再用适量水分散提取物后，依次用乙酸乙酯，正丁醇萃取，萃取液挥干后得到罗勒提取物 (罗勒乙酸乙酯、罗勒正丁醇提取物)，冷冻干燥。实验时用适量的二甲基亚砜DMSO溶解后，用DMEM培养基稀释成所需的质量浓度，再以0.22μm滤器过滤，放置4℃冰箱保存备用。

1.3.2 细胞培养 复苏后的RAW264.7细胞转入细胞培养瓶中，加入含有10%胎牛血清、青霉素100μg/mL、链霉素100μg/mL的DMEM高糖培养基，37℃，5%CO2培养箱中培养，约3～5 d细胞铺满80%瓶底后，用0.25%胰蛋白酶消化约3～5 min后传代。根据需要部分细胞继续传代培养，部分收集计数后冻存备用。

1.3.3 绘制RAW264.7细胞的生长曲线 取生长状态良好的细胞，采用一般的传代方法进行消化，制成细胞悬液。以1×105个/mL的密度将细胞接种于96孔板中，按MTT法［9］，于490 nm波长处测定OD值，每天1次，连续10 d。以培养时间为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

1.3.4 观察罗勒提取物对正常RAW264.7细胞生长的影响 以适量的二甲基亚砜溶液DMSO溶解罗勒乙酸乙酯和罗勒正丁醇提取物以后，以含10%FBS和双抗的DMEM培养基稀释成所需药物溶液 (400、200、100、50、25μg/mL)，稀释后的药物溶液中DMSO的终体积分数控制在0.5%以内 (预试验发现12.5μg/mL的药物溶液在任何一个时间段对细胞的生长均无明显作用，而细胞加入600、800μg/mL的药物溶液后，到48 h细胞就会脱落，导致死亡)，于4℃ 冰箱备用。按MTT法于490 nm波长处测定24、48、72、96 h时的OD值，求出IC50值，并计算细胞的存活率。

1.3.5 罗勒提取物对经脂多糖刺激的RAW264.7细胞生长的影响 采用细胞存活率为90%左右的药物浓度，即罗勒乙酸乙酯提取物和罗勒正丁醇提取物最大给药质量浓度为100μg/mL。再设五个梯度 (公比为2)，配置时以DMEM培养基稀释，通过MTT法检测罗勒提取物对不同时间脂多糖处理后的RAW264.7细胞生长的影响。实验步骤:将指数生长期的RAW264.7细胞以1×105个/mL的密度接种于96孔培养板中，每孔200μL，设空白组，模型组 (以脂多糖刺激致炎)，阳性对照组(白三烯B4终浓度为100μmol/L)和给药组 (不同质量浓度的罗勒提取物)，每组4个复孔，放置37℃，5%CO2培养箱中培养24 h。次日弃去旧培养基，除空白组外，其余每孔均加入脂多糖溶液200μL(1 mg/L)，于培养箱中孵育12 h后，弃去每孔上清液，空白组与模型组加入新鲜培养基，其它组分别加入配置好的各组药物，每孔200μL，继续培养12、24、48 h。依照MTT法，于490 nm波长处测定OD值，计算细胞的存活率。

1.3.6 罗勒提取物在体外对5-脂氧酶活性的影响

将指数生长期的RAW264.7细胞以1×105个/mL的密度接种于96孔培养板中，每孔200μL，设空白组，模型组 (以脂多糖刺激致炎)，阳性对照组(白三烯B4终浓度为100μmol/L)和给药组 (不同质量浓度的罗勒提取物)，每组4个复孔，放置37℃，5%CO2培养箱中培养24 h。次日更换旧培养基，除空白组以外的其它孔均加入终质量浓度1 mg/L的脂多糖进行干预，继续培养12 h后，给药组分别加入配置好的不同质量浓度的罗勒提取物，空白组和模型组加入终体积分数为0.5%的DMSO，放置孵箱中继续孵育。24 h后每个组加入终浓度为10μmol/L的底物花生四烯酸，37℃孵育30 min，收集细胞上清液，－20℃冻存待测。用ELISA法 (严格按照试剂盒说明进行操作)测定细胞上清液中白三烯B4的浓度，并计算抑制率。

抑制率 =［(模型组OD值 －给药组OD值)/模型组OD值］×100%

2 结果

2.1 MTT法绘制RAW264.7细胞的生长曲线 经过观察RAW264.7细胞10 d的基本生长规律，发现接种后的24 h内细胞的吸光度有一定的下降，再经过24 h的滞留期后，细胞将进入一个对数生长期，从接种后的第7天开始细胞的生长保持在一个比较平稳的状态。所得结果显示，24 h与48 h的OD值与0 h的OD值相比差异没有统计学意义(P＞0.05);3～10 d，OD值结果与0 h组比较，差异有统计学意义 (P＜0.05)。根据此结果确定RAW264.7细胞在接种后的第48小时开始进入对数生长期，即视该时间段为干预细胞的最佳时期，可以较合理地观察说明干预因素对细胞生长规律的影响。根据RAW264.7细胞生长规律随时间的变化绘制出细胞生长曲线图，见图1。

图1 MTT法绘制RAW 264.7细胞生长曲线Fig.1 Cell growth curve of RAW 2647 by MTT

2.2 MTT法确定罗勒提取物对正常RAW264.7细胞生长的影响

2.2.1 罗勒乙酸乙酯提取物对正常RAW264.7细胞生长的影响 在体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞中加入终质量浓度为25、50、100、200、400μg/mL的罗勒乙酸乙酯提取物分别培养24、48、72、96 h后，可发现细胞的生长会受到不同的影响。结果表1。

表1 罗勒乙酸乙酯提取物在不同时间作用下对RAW 264.7细胞增殖的影响 (±s，n=3)Tab.1 Effect of Ocimum basilicum L．ethyl acetate extract on the proliferation of RAW 264.7 cells in the different time(±s，n=3)

表1 罗勒乙酸乙酯提取物在不同时间作用下对RAW 264.7细胞增殖的影响 (±s，n=3)Tab.1 Effect of Ocimum basilicum L．ethyl acetate extract on the proliferation of RAW 264.7 cells in the different time(±s，n=3)

注:与空白组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与模型组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01

分 组OD值24 h 48 h 72 h 96 h空白组 0.296±0.053 0.381±0.033 0.389±0.019 0.466±0.019模型组 0.280±0.021 0.377±0.009 0.379±0.028 0.453±0.022罗勒乙酸乙酯提取物25 μg/L组 0.285±0.012 0.379±0.020 0.386±0.010＊＊## 0.371±0.018＊＊##罗勒乙酸乙酯提取物50 μg/L组 0.267±0.013*# 0.329±0.029＊＊## 0.369±0.021*# 0.299±0.011＊＊##罗勒乙酸乙酯提取物100 μg/L组 0.266±0.018*# 0.322±0.044＊＊## 0.365±0.017*# 0.284±0.019＊＊##罗勒乙酸乙酯提取物200 μg/L组 0.258±0.037*# 0.281±0.019＊＊## 0.310±0.023＊＊## 0.213±0.013＊＊##罗勒乙酸乙酯提取物400 μg/L组 0.062±0.011＊＊## 0.095 ±0.022＊＊## 0.048±0.025＊＊## 0.024±0.012＊＊##

除400μg/mL以外的其他剂量给药组，在给药后的72 h之前细胞的吸光度会一直升高，72 h之后会持续下降。组间分析结果表明，细胞的存活率随着给药质量浓度的增大而不断降低，具有质量浓度依赖性。24 h时的IC50值为312.5μg/mL，给药质量浓度为400μg/mL时，细胞存活率在20%以下，对RAW264.7细胞产生毒性作用。

2.2.2 罗勒正丁醇提取物对正常RAW264.7细胞生长的影响 在体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞中加入终质量浓度为25、50、100、200、400μg/mL的罗勒正丁醇提取物分别培养24、48、72、96 h后，可发现细胞的生长会受到不同的影响。给药后的24 h内，25、50μg/mL的药物质量浓度对RAW264.7细胞具有促进增殖的作用，细胞存活率为106%、102%。结果如表2所示，在给药后的72 h之前，各个给药组细胞的吸光度持续升高，72 h之后反而下降。组间分析结果表明，细胞的存活率随着给药剂量的增大而不断下降，具有一定的剂量依赖性。在24 h的IC50值为350.9μg/mL，达到400μg/mL时，对RAW264.7细胞产生毒性作用。

表2 罗勒正丁醇提取物在不同时间作用下对RAW 264.7细胞增殖的影响 (±s，n=3)Tab.2 Effect of Ocimum basilicum L．butanol acetate extract on the proliferation of RAW 264.7 cells in the different time(±s，n=3)

表2 罗勒正丁醇提取物在不同时间作用下对RAW 264.7细胞增殖的影响 (±s，n=3)Tab.2 Effect of Ocimum basilicum L．butanol acetate extract on the proliferation of RAW 264.7 cells in the different time(±s，n=3)

注:与空白组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与模型组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01

分 组OD值24 h 48 h 72 h 96 h空白组 0.296±0.053 0.381±0.033 0.389±0.019 0.466±0.019模型组 0.280±0.021 0.377±0.009 0.379±0.028 0.453±0.022罗勒正丁醇提取物25 μg/mL组 0.313±0.014 0.375±0.016 0.377±0.012＊＊## 0.337±0.013＊＊##罗勒正丁醇提取物50 μg/mL组 0.302±0.019* 0.328±0.014＊＊## 0.363±0.012＊＊## 0.281±0.014＊＊##罗勒正丁醇提取物100 μg/mL组 0.287±0.009* 0.309±0.015＊＊## 0.357±0.032＊＊## 0.276±0.019＊＊##罗勒正丁醇提取物200 μg/mL组 0.219±0.013*# 0.277±0.019＊＊## 0.333±0.009＊＊## 0.261±0.010＊＊##罗勒正丁醇提取物400 μg/mL 组 0.128±0.007＊＊## 0.174 ±0.016＊＊## 0.192±0.011＊＊## 0.067±0.017＊＊##

2.3 罗勒有效提取物对经脂多糖刺激的RAW264.7细胞生长的影响 每个时间段的模型组与对应的空白组相比较，其差异具有统计学差异(P＜0.05)，说明细胞致炎成功。经脂多糖刺激的RAW264.7细胞受到各组药物作用12 h后，各组药物与模型组相比较，其差异无统计学意义 (P＞0.05)。24 h和48 h，除6.25μg/mL组外，其它给药组与脂多糖组相比其差异具有统计学差异(P＜0.05)，对经脂多糖刺激的RAW264.7细胞均有增殖作用。结果见表3。

表3 罗勒提取物对经脂多糖刺激的RAW 264.7细胞的增殖作用 (±s，n=3)Tab.3 Proliferation to RAW 264.7 cells of polar extracts of Ocimum basilicum L．stimulated by lipopolysaccharide(±s，n=3)

表3 罗勒提取物对经脂多糖刺激的RAW 264.7细胞的增殖作用 (±s，n=3)Tab.3 Proliferation to RAW 264.7 cells of polar extracts of Ocimum basilicum L．stimulated by lipopolysaccharide(±s，n=3)

注:与空白组比较，#P ＜0.05，#P ＜0.01;与模型组相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

分 组 剂量12 h 24 h 48 h空白组 －0.682±0.471 0.729±0.056 0.889±0.071模型组 1.00μg/mL 0.307±0.109# 0.223±0.057## 0.076±0.001##吲哚美辛 10－7 mol/L 0.531±0.037 0.597±0.022＊＊ 0.623±0.012＊＊阳性对照组 10－4 mol/L 0.496±0.023 0.538±0.045＊＊ 0.551±0.031＊＊罗勒乙酸乙酯提取物 6.25μg/mL 0.356±0.092 0.335±0.015 0.303±0.044＊＊罗勒乙酸乙酯提取物 12.50μg/mL 0.374±0.026 0.384±0.003＊＊ 0.650±0.158＊＊罗勒乙酸乙酯提取物 25.00μg/mL 0.456±0.174 0.552±0.137＊＊ 0.667±0.114＊＊罗勒乙酸乙酯提取物 50.00μg/mL 0.545±0.099 0.631±0.048＊＊ 0.724±0.077＊＊罗勒乙酸乙酯提取物 100.00μg/mL 0.555±0.015 0.636±0.036＊＊ 0.784±0.091＊＊罗勒正丁醇提取物 6.25μg/mL 0.487±0.211 0.273±0.011 0.183±0.011罗勒正丁醇提取物 12.50μg/mL 0.528±0.233 0.501±0.042＊＊ 0.414±0.001＊＊罗勒正丁醇提取物 25.00μg/mL 0.496±0.079 0.526±0.132＊＊ 0.537±0.131＊＊罗勒正丁醇提取物 50.00μg/mL 0.522±0.109 0.574±0.041＊＊ 0.617±0.014＊＊罗勒正丁醇提取物 100.00μg/mL 0.525±0.072 0.619±0.151＊＊ 0.676±0.019＊＊

2.4 罗勒有效提取物在体外对5-脂氧酶活性的影响 由表4得出，模型组与空白组比较，差异具有统计学意义 (P＜0.01)，证明细胞模型建造成功。各药组与模型组相比，差异具有统计学意义 (P＜0.01)，可以判断罗勒乙酸乙酯提取物和罗勒正丁醇提取物均对白三烯B4均有抑制作用，罗勒乙酸乙酯提取物的抑制作用大于罗勒正丁醇提取物。而对白三烯B4的抑制作用随着给药剂量的提高逐渐增大，存在着一定的量效关系。可见，罗勒提取物对5-脂氧酶的活性有抑制作用。

3 讨论

确定有效给药剂量是进行药物干预实验之前的非常重要的试验步骤。本研究首先通过维药罗勒不同提取物对正常RAW264.7细胞的干预实验，确定了不同质量浓度的维药罗勒乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物对正常RAW264.7细胞有不同的影响，而罗勒乙酸乙酯提取物对细胞增殖的影响大于罗勒正丁醇提取物，400μg/mL的罗勒乙酸乙酯提取物对RAW264.7细胞的毒性大于相同质量浓度的罗勒正丁醇提取物，俩者均降低了细胞的存活率。显微镜下观察发现，药物质量浓度达到400μg/mL时，细胞的形态出现明显的损伤现象 (细胞体积缩小，突起消失，间隙增大)，这可能与巨噬细胞吞噬了大量的脂质后转变为泡沫细胞，从而加重细胞的损伤有关［10］。因此在进行药效学实验时，将此质量浓度排除在外。在相同的时间段内，罗勒乙酸乙酯提取物和罗勒正丁醇提取物均随着质量浓度的增大，其对细胞的毒性也逐渐增大。可以推断罗勒提取物质量浓度与其对细胞的毒性作用之间有着一定的量效关系。

表4 罗勒不同提取物对5-脂氧酶活性的影响 (±s，n=3)Tab.4 Effects on 5-lipoxygenase enzyme activity of different extracts of Ocimum basilicum L．(±s，n=3)

表4 罗勒不同提取物对5-脂氧酶活性的影响 (±s，n=3)Tab.4 Effects on 5-lipoxygenase enzyme activity of different extracts of Ocimum basilicum L．(±s，n=3)

注:与空白组比较，#P＜0.05;与模型组相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与罗勒乙酸乙酯比较，+P＜0.01

分 组 剂 量 白三烯B4质量浓度/(ng·L－1)抑制率/%空白组 － 121.69±5.48 －模型组 1μg/mL 293.45±7.41## －阳性对照组 100μmol/L 133.24±4.46＊＊ 54.59罗勒乙酸乙酯提取物 100μg/mL 167.91±23.99＊＊ 42.78罗勒乙酸乙酯提取物 50μg/mL 174.04±16.91＊＊ 40.69罗勒乙酸乙酯提取物 25μg/mL 186.83±3.38＊＊ 36.33罗勒正丁醇提取物 100 μg/mL 180.08±15.25＊＊+ 38.63罗勒正丁醇提取物 50 μg/mL 181.89±13.46＊＊+ 38.02罗勒正丁醇提取物 25 μg/mL 215.71±30.32＊＊+26.49

在进行检测炎症因子水平之前，需要考虑维药罗勒提取物对被脂多糖刺激致炎后的RAW264.7细胞会有什么样的影响并且确定其给药剂量。脂多糖是一种重要的致病介质，来源于革兰氏阴性细菌细胞壁。根据进入机体的剂量不同，会引起不同程度的炎症和中毒反应［11-12］。脂多糖对天然免疫细胞表达细胞因子的调节作用是脂多糖致病的核心机制［13］。本实验所采用的小鼠腹腔巨噬细胞属免疫细胞，当被脂多糖刺激之后，细胞的生理环境将会发生变化，细胞的存活率也将随之下降。结合以上MTT实验结果，选定安全剂量范围，对脂多糖刺激后的细胞进行了试验观察，发现罗勒提取物对经脂多糖刺激后的细胞有增殖作用，这可能与其抑制了脂多糖所致的炎症因子有关。

多不饱和脂肪酸花生四烯酸 (arachidonic acid)是多种生物活性物质的前提，作为一种重要的人体必需脂肪酸，它具有重要的生理，病理作用。花生四烯酸代谢网络是炎症代谢网络中的一个核心网络［14］。人体的花王四烯酸代谢网络中，主要有两条代谢路径:①通过环氧酶 (cyclooxygenase，COX)的作用生成各种前列腺素 (prostaglandins，PGs);②通过脂氧酶 (5-lipoxygenase)的作用生成白三烯 (leukotrienes)，脂质过氧化物［15］，这些代谢产物可能引起或加重机体的一些炎症反应。现有研究证明，生物组织细胞膜富含的花生四烯酸经专一酶催化产生的代谢物除了调控许多生理过程外，还在炎症反应中起重要作用［16］。

脂氧合酶 (Lipoxygenase，LOX)是一种氧合酶，作为一种含非血红素铁的蛋白，其代谢产物白三烯类物质是一种强烈的炎症介质，对哮喘、类风湿、过敏性鼻炎及癌症等常见多发病的发生发展起到很大的作用。通过检测罗勒提取物对5-脂氧酶代谢产物白三烯B4的影响发现，给药组的存活率明显高于模型组。这是因为罗勒提取物抑制了5-脂氧酶活性，炎症因子白三烯B4的释放受到限制。罗勒乙酸乙酯提取物对5-脂氧酶代谢产物白三烯B4的抑制率明显大于罗勒正丁醇提取物，罗勒乙酸乙酯提取物可能是罗勒发挥抗炎作用的有效部位。

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