黄连解毒汤对大鼠急性心肌缺血再灌注损伤的保护作用1）

付晓春，陈建军，王舰平

黄连解毒汤（HLJDT）源于唐·外台秘要［1］，由黄连、黄柏、黄芩、栀子4味中药构成，近年来研究发现黄连解毒汤能明显改善脑缺血损伤［2，3］，并且能显著降低胆固醇，改善血栓及血液黏滞性［4］，提示黄连解毒汤对由于心肌缺血引起的心肌损伤具有保护作用。心肌损伤中的缺血再灌注损伤（I／R）是一个复杂的过程，研究发现炎症反应在心肌缺血再灌注损伤中起了非常重要的作用［5］，故本实验旨在观察HLJDT在急性I／R过程中对血清肿瘤坏死因子（TNF－α）、白介素－1β（IL－1β）、肌酸激酶（CK）及NF－κB表达的影响，探讨HLJDT在此过程中是否具有保护作用。

1 材料与方法

1．1 主要试剂 黄连解毒汤的制备：取黄连、栀子、黄柏、黄芩4味药（1．5∶1．5∶1∶1）加水煮沸，合并3次药液，恒温100℃浓缩制成黄连解毒汤，每毫升含生药5g。复方丹参片（FFDS）广州白云山制药总厂中药厂，批号：090607）。实验中所用的缓冲液均由国产分析纯级试剂配制。TNF－α、IL－1ΒELISA试剂盒购自武汉博士德。

1．2 动物模型及分组 健康雄性SD大鼠56只，体重250g～300g，随机等分为7组［6，7］，每组8只。假手术组、心肌缺血再灌注组，溶剂（1%CMC－Na）对照组；黄连解毒汤（HLJDT）高、中、低剂量组（200mg／kg、400mg／kg及800mg／kg），复方丹参组（500mg／kg）。连续给药7d，缺血再灌注不作药物处理，末次给药24h后，腹腔注射戊巴比妥钠4．5mg／100g，麻醉动物后行气管切开接微型呼吸机人工呼吸，呼吸频率60次／min，潮气量2mL／100g。沿胸骨左缘第4肋骨开胸在左心室、右心室与左心房交界处结扎／开放左冠状动脉前降支，建立心肌缺血再灌注模型。假手术组丝线穿过冠状动脉前降支但不结扎。30min后放开丝线恢复冠脉再通40min。

1．3 观察指标和检测方法

1．3．1 血清 TNF－α、IL－1β、CK水平的测定 实验终点，股静脉取血2mL，室温静置1h，后3000r／min离心5min，分离出血清，－80℃冰箱中保存。

1．3．2 心肌组织梗死区面积的测定 动物缺血30min再灌注40min时，将左冠状动脉前降支重新结扎，经舌静脉注射0．5%伊文氏蓝1．5mL，待缺血区清楚显示后迅速取出心脏，用冰冻生理盐水冲洗后剪除心房，－20℃冰冻10min，用心脏切片机垂直心脏长轴将其切成1mm薄片（4～5）张，放入2mL氯化三苯基四氮（Sigma公司，美国）中37℃染色15min，用 HPIAS－2000图像分析系统测定缺血区和坏死区面积，分别计算缺血区面积、梗死区面积占左心室面积的百分比。

1．3．2 用EMSA方法测定NF－κB的表达 取心尖以上梗死区心肌组织100mg放入1mL裂解缓冲液中（50mmol／LTrizol、100mmol／L二硫苏糖醇、2%SDS，0．1%溴酚蓝，10%的甘油）冰上匀浆30min，4℃12000g／min离心20min，取上清液，用Lowry法测定蛋白含量。取50μL样品和等体积溴酚蓝沸水煮3min，上样进行SDS－PAGE蛋白电泳，完后转印到PVDF膜上，取出膜用BSA封闭，再用TSB－T溶液洗膜三次，加入兔抗大鼠NF－κBp65（Neomarkers公司，美国）孵育10h，用TSB－T溶液洗后加入羊抗兔IgG（KPL公司，美国）孵育2h，TSB－T溶液漂洗，最后进行增强化学发光反应，将PVDF膜放入等体积配制的LumiGloAB发光液中，快速移至暗室，放在X光片下曝光显影。扫描X光片，以灰度值表示NF－κB的表达水平。

2 结 果

2．1 各组大鼠TNF－α、IL－1β、CK水平 与假手术组比较，I／R组血清 TNF－α、IL－1β、CK明显增高（P＜0．05）；与I／R组比较，HLJDT高中低剂量组、FFDS组血清 TNF－α、IL－1β、CK 降低。详见表1。

表1 黄连解毒汤对大鼠I／R血清TNF－α、IL－1β、CK水平的影响（±s）

表1 黄连解毒汤对大鼠I／R血清TNF－α、IL－1β、CK水平的影响（±s）

与假手术组比较，1）P＜0．05；与I／R组比较，2）P＜0．05

组别 n 剂量（mg／kg） TNF－α／（ng／L） IL－1β（ng／L） CK（U／L）假手术组 8 － 73．06±14．79 38．13±10．79 684．2±41．2 I／R组 8 － 193．27±29．431） 95．62±19．311） 992．7±42．81）1%CMC－Na对照组 8 － 191．34±28．65 94．39±18．66 994．1±39．5 HLJDJN低剂量组 8 200 163．21±20．472） 80．27±18．452） 873．6±35．72）HLJDJN 中剂量组 8 400 127．15±19．592） 67．35±16．292） 804．3±32．92）HLJDJN高剂量组 8 800 101．32±17．732） 59．76±14．312） 786．5±36．42）复方丹参对照组 8 500 114．26±18．022） 62．33±15．282） 792．4±28．72）

2．2 心肌组织梗死区面积的测定 心肌缺血再灌注组的缺血面积明显高于假手术组（P＜0．05），1%CMC－Na对照组，HLJDT低剂量组、HLJDT中剂量组缺血面积百分比与缺血再灌注组比较无统计学意义，HLJDT高剂量组、复方丹参组与缺血再灌注组及1%CMC－Na对照组比较缺血面积百分比均显著减少（P＜0．05）。心肌缺血再灌注组的梗死面积明显高于假手术组（P＜0．05），HLJDT低剂量组、中剂量组、HLJDT高剂量组、复方丹参组与缺血再灌注组及1%CMC－Na对照组比较梗死面积百分比均显著减少（P＜0．05）。详见表2。

2．3 用EMSA测定NF－κB的表达及活性 心肌缺血再灌注组NF－κB活性明显高于假手术组（P＜0．05），1%CMC－Na对照组NF－κB活性与缺血再灌注组比较无统计学意义，HLJDT各剂量组、复方丹参组与缺血再灌注组及1%CMC－Na对照组比较NF－κB活性均显著降低（P＜0．01）。详见表2。

表2 黄连解毒汤对I／R心肌缺血面积、梗死面积的影响（±s）

表2 黄连解毒汤对I／R心肌缺血面积、梗死面积的影响（±s）

与假手术组比较，1）P＜0．05；与I／R组比较，2）P＜0．05；与1%CMC－Na对照组比较，3）P＜0．05

组别 n 剂量／（mg／kg） 缺血面积（%） 梗死面积（%） NF－κB假手术组 8 － 3．31±1．72 4．52±1．75 1．09±0．18 I／R组 8 － 41．52±2．311） 48．33±2．621） 3．92±0．531）1%CMC－Na对照组 8 － 43．81±1．76 46．35±4．18 3．87±0．28 HLJDT低剂量组 8 200 38．46±2．172）3） 35．70±3．342）3） 3．01±0．152）3）HLJDT 中剂量组 8 400 35．24±2．822）3） 28．43±2．452）3） 2．28±0．212）3）HLJDT高剂量组 8 800 30．78±1．832）3） 21．41±2．812）3） 1．69±0．132）3）复方丹参对照组 8 500 29．35±2．252）3） 23．28±3．022）3） 2．35±0．132）3）

3 讨 论

心肌缺血再灌注时伴随血浆炎性细胞因子及抗炎细胞因子的升高，其增高程度和心肌微循环的损伤程度有关，心肌组织水平灌注不良越严重，细胞因子升高越明显［8］。炎症细胞因子TNF－α、IL－1β的增加和缺氧均可激活 NF－κB，活化的 NF－κB迅速进入核内启动炎症细胞因子、选择素和黏附分子的表达，再升高的NF－κB等进一步刺激NF－κB，形成正反馈，导致细胞因子水平不断升高［9］。抑制NF－κB的激活在I／R引起的心肌损伤中可能起一定程度的保护作用［10］。缺血再灌注时剧增的氧自由基加重细胞膜的损伤，细胞内CK释放入血，引起相应酶在血液中浓度升高，这些酶释放入血的多少与心肌坏死程度呈正相关，故测定其血清含量被认为有助于心肌缺血损伤程度的诊断。

本研究结果显示，缺血再灌注损伤时，TNF－α、IL－1β活性显著升高，NF－κB表达增多，血清CK增加，心肌组织梗死面积增加；而 HLJDT处理后，TNF－α、IL－1β活性显著降低，NF－κB表达降低，血清CK及心肌组织梗死面积降低，提示HLJDT通过抑制TNF－α、IL－1β释放，并且抑制了下调 NF－κB表达，从而减轻炎症反应，实现对缺血再灌注心肌的保护，同时HLJDT抑制了血清CK的释放并降低了心肌组织的梗死面积。

HLJDT对缺血再灌注心肌的保护作用可能与其抑制NF－κB的活性、减少促炎细胞因子的释放、并减少血清CK的释放有关。然而心肌缺血／再灌注损伤是一多渠道、多环节的复杂病理生理过程，HLJDT对损伤的保护作用，其相应机制以及临床应用价值，都有待进一步深入系统的研究。

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