薄层扫描法测定复聪片中淫羊藿苷的含量

李 红 蒋孟良

湖南中医药大学，湖南长沙 410208

复聪片由黄芪、丹参、淫羊藿、当归、骨碎补、熟地黄、水蛭、炮山甲、泽泻、石菖蒲等中药组成，是由耳聋左磁丸加减而成[1]，能清肝胆、利湿热、补肾活血、益气养血，主要用于治疗由于肾虚等病因引起的听力下降。淫羊藿是本方中的重要组分。淫羊藿为小檗科植物淫羊藿、箭叶淫羊藿、巫山淫羊藿、朝鲜淫羊藿等多种淫羊藿的茎叶。淫羊藿是多年生草本，味辛、甘，性温；归肝经；体轻气雄，可升可降；具有壮肾阳、坚筋骨、祛风湿等功效；主治阳痿、遗精早泄、精冷不育、尿频失禁、肾虚喘咳、腰膝酸软、筋骨挛急、风湿痹痛、半身不遂、四肢不仁。淫羊藿主要含黄酮类化合物、木脂素、生物碱、挥发油等。淫羊藿的叶和茎中含淫羊藿苷（icariin）、淫羊藿次苷（icariside）、去氧甲基淫羊藿苷（des-O-Methylicariin）、β-去水淫羊藿素（β-anhy-Droicaritin）、淫羊藿糖苷（epimedoside）A、B、C、D、E，淫羊藿苷是其主要有效成分之一[2]。现代研究表明，淫羊藿苷具有提高性功能、抗衰老、改善免疫系统、增强心肌收缩力、降血压、镇咳、祛痰和平喘、抗炎及抗病原微生物、改善血流动力和血液流变的作用。本实验采用薄层扫描法[3-4]测定复聪片中淫羊藿苷的含量，方法简便易行，并且有较好的精密度和重复性，可以用于该产品的质量控制。现将实验结果报道如下：

1 仪器与试药

1.1 仪器

CS-930型薄层扫描仪 （日本岛津）；AB135-S型电子天平（0.01 mg，METTLER TOLEDO）；DK-S22 电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；SK3300A型粉碎机（上海科导超声仪器有限公司）；WGLL-125BE型电热鼓风干燥箱（天津泰斯特仪器有限公司）；5 μL 微量进样器（上海第三注射器厂）；索氏提取器。

1.2 试药

复聪片（湖南中医药大学第二附属医院）；硅胶G（青岛海洋化工厂）；淫羊藿苷对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用）；三氯化铝、乙醇、醋酸乙酯、丁酮、甲醇等试剂均为分析纯。

2 方法及结果

2.1 薄层层析条件

2.1.1 薄层板 含0.5%羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板（10 cm×20 cm），于105℃活化1 h，置于干燥器中备用。展开剂：醋酸乙酯-丁酮-甲醇-水（10∶1∶1∶1）。

2.1.2 显色剂 5%三氯化铝-乙醇溶液。

2.2 扫描条件[5]

单波长反射法锯齿形程序扫描；扫描波长λ=272 nm；狭缝为1.2 mm×1.2 mm，Sx=3，灵敏度中等。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的淫羊藿苷对照品0.9 mg，用甲醇溶解并用2 mL 容量瓶定容，摇匀备用（浓度：0.45 mg/mL）。

2.4 供试品溶液的制备

取无糖衣的复聪片10 片，碾碎，置于索氏提取器中，加入50 mL 醋酸乙酯，连续回流提取至无色（约3.5 h）。将提取液水浴蒸干，用水溶解，上聚酰胺柱（层板柱为1.5 cm×20 cm，5 g 聚酰胺），先用70 mL 蒸馏水洗涤，洗涤液弃去；继用70 mL 70%乙醇洗涤，收集乙醇洗脱液，水浴蒸干，用甲醇溶解并定容到2 mL，摇匀备用。

2.5 阴性溶液的制备

精密称取1/10处方量的各药物（淫羊藿除外），依照其生产工艺制备阴性样品100 片，取其中10 片，按样品供试液的方法制备阴性样品溶液。

2.6 线性关系的考察

精密吸取对照品溶液（0.45 mg/mL）10、15、20、25、30 μL，分别点样于同一块薄层板上，按上述条件，依法展开，扫描测定。以点样量（μg）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标。见表1。

表1 线性关系考察结果（n=5）

结果显示，该条件下回归方程：Y=4120.19X－15 458.92，相关系数：r=0.999 5，提示淫羊藿苷在 4.50～13.50 μg 范围内含量与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.7 同板精密度试验

在同一块薄层板上，分别点相同量对照品溶液15 μL的6个点，依法展开，测定其峰面积积分值，结果RSD=4.56%，表明具有较好的同板精密度。见表2。

表2 同板精密度试验结果

2.8 异板精密度试验

在6 块不同薄层板上，点相同量对照品溶液15 μL 的6个点，依法展开，测定其峰面积积分值，结果RSD=5.21%，n=6，表明具有较好的异板精密度。见表3。

表3 异板精密度试验结果

2.9 稳定性试验

取供试品溶液按文中所述含量测定方法，显色后立即测定，然后每隔30 min 测定一次，连续测定3 h，结果RSD=3.35%，n=7，表明3 h 内测定结果基本稳定。

2.10 回收率试验

精密称取已测知淫羊藿苷含量的复聪片粉末及一定量的淫羊藿苷对照品，按样品测定方法进行测定，结果淫羊藿苷的平均回收率为98.10%，RSD 为1.31%。见表4。

表4 回收率试验结果（n=6）

2.11 样品含量测定

精密吸取对照品溶液15μL 和25μL，供试品溶液20μL，分别点于同一块薄层板上，同前展开测定，采用外标两点法计算含量。见表5。

表5 样品含量测定结果

3 讨论

耳聋指不同程度的听力下降，耳聋又常常由耳鸣发展而来，正如《医学入门》所说：“耳鸣乃是聋之渐也”，可从其性质及病程进行辨证，如《景岳全书·耳证》所说：“凡暴鸣而声大者多实；渐鸣而声细者多虚”。随着我国人口年龄的老龄化，老年性聋的发病率有增高的趋势，其发病情况为城市高于农村，工业人口高于农业人口，心血管疾病患者高于一般居民，男性听力减退比女性更为显著，年龄越大，发病率越高，听力减退也越明显。因其病程较长，进展缓慢，故属中医学耳聋、久聋范畴。中老年人由于年龄增大的关系，脏腑日损，阴精暗耗，气血渐衰，耳目功能减退，以致出现重听耳鸣，甚则聋闭。中医认为，精血不足或气血亏损，以及久病入络，均可致窍络瘀阻，耳窍失养，功能失司。

复聪片是我校第二附属医院谭敬书教授治疗耳聋的有效验方，用之老年性聋疗效颇佳[6]。该方以填精充髓，补益气血，活血化瘀，通络复聪为治则组方，疗效显著。周光源等[7]用复聪片治疗中老年耳聋114例，并以耳聋左慈丸治疗的78例作对照，结果，复聪片对耳骨导听阈的总有效率为83.9%，对病程中度患者的总有效率为88.3%，均明显优于对照组[7]。药理研究表明：复聪片具有支持蜗内神经结构的作用，这可能与促进神经生长因子与其受体的结合以及通过保护毛细胞，间接促进神经生长因子的产生有关[6]。徐绍勤等[8]对庆大霉素（GM）致豚鼠的耳毒性反应进行拮抗及治疗研究。证实复聪片可减轻GM 的耳毒性反应，保护耳蜗听毛细胞，拮抗GM 所致之听阈升高，电镜观察显示毛细胞损害减轻。对已由GM 致聋的豚鼠，复聪片可促使受损毛细胞形态及功能在一定程度上恢复，有效降低GM耳中毒豚鼠听阈，阻止GM 停药后迟发的听阈升高，表明复聪片对GM 所致的豚鼠耳中毒有一定的防治作用。彭斌等[9]报道，复聪片对老年大鼠听觉脑干诱发电位反应阈（ABR）具有明显抑制作用，复聪片与模型组比较，差异有高度统计学意义（P<0.01）[9]，复聪片对大鼠耳蜗核神经元数量减少有明显的抑制作用，且神经细胞肿胀、胞核及胞浆皱缩等情况明显较老年对照组为轻[10]。临床与药效试验均证实复聪片对老年性耳聋具有良好疗效。

用醋酸乙酯-丁酮-甲醇-水（10∶1∶1∶1）作展开剂，在20℃以上温度展开时，会出现拖尾现象。这主要是由于温度升高使展开剂黏度降低，致使展开速度过快而导致。故薄层展开的温度应控制在15℃左右最为适宜。

[1]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，20 10：674.

[2]高学敏.中药学[M].北京：中国中医药出版社，2010：494-495.

[3]林昱，李新田，邱财荣，等.薄层扫描法测定接骨丹胶囊中士的宁[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（7）：53-54.

[4]周芳礼，黄瑞松，苏青，等.薄层扫描法测定不同产地喜树果中的喜树碱[J].华西药学杂志，2008，23（5）：610-612.

[5]丁晨光，李修禄.淫羊藿生药中淫羊藿苷的高效薄层扫描测定[J].药物分析杂志，1991，11（1）：33-34.

[6]徐绍勤，刘佳运，彭斌，等.复聪片对老年大鼠蜗内神经结构影响的实验研究[J].中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志，2001，9（1）：6-8.

[7]周光源，谭奕，李凡成，等.复聪片治疗中老年耳聋114例临床观察[J].中国中西医结合杂志，1999，19（2）：108-109.

[8]徐绍勤，欧阳林，曾省三，等.复聪片对豚鼠庆大霉素耳中毒的防治作用[J].中药新药与临床药理，1999，10（6）：341-343.

[9]彭斌，徐绍勤，刘佳远，等.复聪片对老年大鼠昕功能影晌的实验研究[J].湖南中医杂志，2003，19（1）：55.

[10]彭斌，徐绍勤，文志.复聪片对老年大鼠耳蜗核神经元数量的影响[J].湖南中医杂志，2009，25（4）：116-118.