雌激素抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠的NF-κB和Rho激酶表达

冯金洲张广慧燕伟平秦新月

雌激素用于治疗多发性硬化(multiple sclerosis，MS)已有报道，但因作用机制和潜在风险未完全明确，故临床应用仍存争议。在MS的实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)模型中抑制Rho激酶的表达能减轻中枢神经系统(central nervous system，CNS)炎性细胞浸润、脱髓鞘程度及临床症状[1-2]，提示Rho激酶参与EAE病理过程。研究发现雌激素可抑制Rho激酶的活性，但具体机制不详[3]。本研究拟探讨雌激素对EAE大鼠Rho激酶表达的影响，并通过NF-κB特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidine dithocarbamate，PDTC)干预，进一步了解雌激素在EAE/MS发挥抗炎和神经保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 研究材料 380～450 g豚鼠8只，雌雄不限，重庆医科大学动物中心提供。180～220g雌性Wistar大鼠60只，第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供。随机数字表法将大鼠分为模型组、对照组、PDTC组、雌激素组，每组15只。

1.2 研究方法

1.2.1 EAE模型的制备 Wistar大鼠行双侧输卵管结扎及卵巢摘除，术后2周wistar大鼠身体状况恢复后制备EAE模型。新鲜豚鼠脊髓制成50%脊髓生理盐水匀浆与完全弗氏佐剂按照1：1制成油包水乳剂，皮下注射共0.5 mL/只。同时于双后肢足背皮下注射百日咳毒素0.2 mL/只[4]。

1.2.2 处理方式 对照组只给予皮下注射二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)。PDTC组于免疫前1d起腹腔注射PDTC(sigma)50 mg/(kg·d)[5]，连续10d。雌激素组大鼠于免疫前1日起腹部皮下注射17β-雌二醇(sigma)20µg/(kg·d)[6]，连续10 d。

1.2.3 神经功能评分 自免疫日起采用5分评分法每日行EDSS神经功能评分(0分：正常，无发病；1分：动物尾无力；2分：双后肢无力；3分：双后肢麻痹；4分：双后肢加前肢瘫痪；5分：濒死状态或死亡[7]。症状介于两级之间则分别记作0.5、1.5、2.5、3.5或4.5分)。以达到或超过1分为临床发病，自免疫日起至临床发病的时间为发病潜伏期。

1.2.4 炎性细胞浸润情况检测 免疫后16 d统一处死取脑组织制作石蜡切片(4µm)，行H-E染色观察脑组织炎性细胞浸润情况。

1.2.5 Rho激酶和NF-κB P65的表达检测 采用免疫组化与western blot方法观察脑组织Rho激酶和NF-κB P65的表达情况。

免疫组化：参照试剂盒说明书，光镜下显色细胞膜、细胞浆棕黄色颗粒(ROCK-Ⅱ，abcam)或细胞浆、细胞核棕黄色颗粒(NF-κB P65，santa cruz)为阳性着色。

Western blot：取新鲜脑组织提取全蛋白，具体方法参照文献[8]，以蛋白/β-actin条带密度的相对值表示蛋白表达水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0进行统计学分析。计量资料均以(x±s)表示，发病率的比较采用χ2检验；四组间计量资料的比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)，进一步两两比较采用Bonfferoni法。检验水准α为0.05。

2 结果

2.1 神经行为学比较 该模型表现为急性单相病程。EAE模型组发病12只，对照组13只，PDTC组和雌激素组各10只，组间发病率无统计学差异(χ2=5.40，P＞0.05)。EAE模型组、对照组、PDTC组和雌激素组最高神经功能评分分别为(2.27±0.36)分、(2.15±0.31)分、(1.93±0.42)和(1.54±0.25)分。4组间最高神经功能评分有统计学差异(F=10.67，P＜0.05)，其中雌激素组比EAE模型组降低(P＜0.05)。

EAE模型组、对照组、PDTC组和雌激素组发病潜伏期分别为(12.95±0.75)d、(12.35±1.02)d、(13.75±0.96)d和(15.10±0.87)d，4组间潜伏期有统计学差异(F=24.69，P＜0.05)。与EAE模型组比较，雌激素组发病潜伏期延长(P＜0.05)。对照组与EAE模型组潜伏期与神经功能评分无统计学差异(P＞0.05)。

2.2 各组大鼠炎性细胞浸润情况 HE染色示模型组脑组织存在明显炎性细胞浸润，血管周围呈“袖套样”典型炎症性改变，脑实质内亦有明显炎性细胞浸润(见图1 A)；PDTC组和雌激素组炎性细胞浸润比EAE模型组明显减轻，血管“袖套样”炎性改变不明显，脑实质内炎性细胞浸润亦明显减少(见图1 B和C)。

2.3 EAE大鼠脑组织NF-κB P65的表达 免疫组化示脑组织中P65主要表达在大脑皮质和海马，各组间表达水平有统计学差异(F=137.60，P＜0.05)。EAE模型组及对照组间表达水平无统计学差异(P＞0.05)，阳性染色除在细胞浆外，还有大量转录入核。而PDTC组和雌激素组表达水平较EAE模型组明显降低(P＜0.01)，且多位于细胞浆中，细胞核激活状态的NF-κB表达很少(见表1及图2 A～D)。

Western blot示EAE模型组、对照组、PDTC组和雌激素组P65表达相对值分别为(0.97±0.05)、(1.11±0.07)、(0.53±0.06)和(0.64±0.07)。4组间表达水平有统计学差异(F=5.88，P＜0.05)，对照组与模型组表达无差异(P＞0.05)，PDTC组、雌激素组与EAE模型组相比有差异(P＜0.01)，PDTC组与雌激素组之间有差异(P＜0.05)，以PDTC组表达最低(见图3)。

2.4 EAE大鼠脑组织Rho激酶表达 免疫组化结果示，脑组织Rho激酶主要表达在大脑皮质和海马，与NF-κB P65的表达部位一致，阳性染色主要见于细胞膜，少部分位于细胞浆(见图2 E～H)。4组Rho激酶表达水平有统计学差异(F=86.82，P＜0.05)，在EAE模型组及对照组两组间表达无统计学差异(P＞0.05)；而PDTC组和雌激素组与EAE模型组比较则表达减少(P＜0.01)(见表1)。

Western blot示EAE模型组、对照组、PDTC组和雌激素组Rho激酶表达相对值分别为(0.87±0.05)、(0.85±0.09)、(0.37±0.05)和(0.41±0.07)。各组间表达有明显差异(F=8.43，P＜0.05)，对照组与模型组表达无差异(P＞0.05)，PDTC组、雌激素组与模型组相比表达有差异(P＜0.01)，PDTC组与雌激素组间表达无差异(P＞0.05)(见图4)。

3 讨论

雌激素治疗MS机制包括抑制T淋巴细胞和巨噬细胞浸润和炎性因子生成，调节Th1/Th17细胞，增加Treg细胞活性，促进神经元和髓鞘存活[9-11]等。本实验给予EAE大鼠17β-雌二醇后能延长发病潜伏期，降低神经功能评分及炎性细胞浸润，验证了雌激素对EAE大鼠的神经保护作用。但并未改变EAE大鼠的发病率，与一些报道[12]略有差异，可能与样本量太小，动物种系及模型不同等因素有关。

图1 H-E染色示脑组织炎性细胞浸润 A：模型组；B：PDTC组；C：雌激素组

图2 免疫组织化学示NF-κB p65(ABCD)和Rho激酶(EFGH)的表达 A、E：模型组；B、F：对照组；C、G：PDTC组；D、H：雌激素组

图3 Western blot示NF-κB p65的表达 a：与模型组比较，经Bonferroni检验，P＜0.01；b：与PDTC组比较，经Bonferroni检验，P＜0.05

图4 Western blot示Rho激酶的表达 a：与模型组比较，经Bonferroni检验，P＜0.01

表1 .各组NF-κB P65，Rho激酶阳性细胞数

NF-κB是广泛存在的转录因子，其活性与EAE的临床症状变化呈一致，NF-κB能上调TNF-α，IL-1等炎性因子和血管粘附分子(VCAM-1，ICAM-1)，调节IL-17，加重MS和EAE临床症状[13]。雌激素在EAE的抗炎作用与抑制NF-κB依赖的转录水平有关[14]，本实验也证实雌激素对NF-κB的抑制作用，可能是雌激素发挥抗炎作用的重要机制。

Rho激酶是轴突生长抑制因子NOGO-A、MAG和OMgp的共下游底物，是抑制神经再生的主要原因。在EAE中Rho激酶失调还可致淋巴细胞向CNS迁移，调节Th1/Th17细胞生成，破坏血脑屏障[15]；抑制Rho激酶能减少IL-6、IL-17等炎性因子浸润和髓鞘破坏[1]，说明Rho激酶具有抗炎和神经保护的双重作用。本研究示雌激素能抑制Rho激酶的表达，可能是雌激素抗炎及神经保护作用的机制之一，但具体通过Rho激酶引起哪些功能效应还需进一步研究。

Hiroki等[16]发现在平滑肌细胞中IL-1β等炎性刺激能上调Rho激酶表达，而将NF-κB基因敲除后Rho激酶的表达降低，说明NF-κB可调控Rho激酶的表达，但在EAE/MS中尚无相关研究。我们前期研究发现雌激素可通过膜表面的雌激素受体α抑制Rho激酶的表达[17]，但胞内通路尚不详。本实验在EAE大鼠给予NF-κB特异性抑制剂PDTC后，Rho激酶表达水平下降，说明NF-κB可调控Rho激酶的表达。予以17β-雌二醇可降低NF-κB和Rho激酶的水平，提示雌激素可能部分通过抑制NF-κB而抑制Rho激酶的表达，可能是雌激素的细胞内作用通路，但机制探讨证据尚不充分，需进一步论证。此外，本研究中雌激素干预属预处理方式，探讨MS发病后雌激素的保护作用更贴近临床和转化医学的要求，故尚需进一步探讨。

[1]Yu JZ,Ding J,Ma CG,et al.Therapeutic potential of experimental autoimmune encephalomyelitis by Fasudil,a Rho kinase inhibitor[J].J Neurosci Res,2010,88(8)：1664-1672.

[2]刘岳婷,侯绍蔚,刘春云,等.法舒地尔通过诱导EAE小鼠Occludin表达抑制其炎性细胞浸润[J].中国神经免疫学和神经病学杂志,2012,19(3)：206-210.

[3]Chrissobolis S,Budzyn K,Marley PD,et al.Evidence that estrogen suppresses rho-kinase function in the cerebral circulation in vivo[J].Stroke,2004,35(9)：2200-2205.

[4]罗家明,秦新月,陈黎燕,等.甲基强的松龙抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎IL-23/IL-17轴机制研究[J].中国神经精神疾病杂志,2008,34(6)：345-348.

[5]Pahan K,Schmid M.Activation of nuclear factor-kB in the spinal cord of experimental allergic encephalomyelitis[J].Neuroscience Letter,2000,287(1)：17-20.

[6]唐曦,唐成林,谢洪武.切除卵巢对大鼠学习记忆和海马雌激素受体α的影响及电针的干预作用[J].中国神经精神疾病杂志,2012,38(11)：662-666.

[7]Bakir S,Mori T,Durand J,et al.Estrogen-induced vasoprotection is estrogen receptor dependent：evidence from the ballooninjured rat carotid artery model[J].Circulation,2000,101(20)：2342-2344.

[8]Han MH,Hwang SI,Roy DB,et al.Proteomic analysis of active multiple sclerosis lesions reveals therapeutic targets[J].Nature,2008,451(7182)：1076-1081.

[9]El-Etr M,Ghoumari A,Sitruk-Ware R,et al.Hormonal influences in multiple sclerosis：new therapeutic benefits for steroids[J].Maturitas,2011,68(1)：47-51.

[10]胡晓,朱加应,黄伟琨,等.雌激素对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的抗炎机制[J].中国神经精神疾病杂志,2011,37(7)：396-400.

[11]Patas K,Engler JB,Friese MA,et al.Pregnancy and multiple sclerosis：feto-maternal immune cross talk and its implications for disease activity[J].J Reprod Immunol,2013,97(1)：140-146.

[12]Elloso MM,Phiel K,Henderson RA,et al.Suppression of experimental autoimmune encephalomyelitis using estrogen receptorselective ligands[J].J Endocrinol,2005,185(2)：243-252.

[13]Brüstle A,Brenner D,Knobbe CB,et al.The NF-κB regulator MALT1 determines the encephalitogenic potential of Th17 cells[J].J Clin Invest,2012,122(12)：4698-4709.

[14]Giraud SN,Caron CM,Pham-Dinh D,et al.Estradiol inhibits ongoing autoimmune neuroinflammation and NF kappaB-dependent CCL2 expression in reactive astrocytes[J].PNAS,2010,107(18)：8416-8421.

[15]Biswas PS,Gupta S,Chang E,et al.Phosphorylation of IRF4 by ROCK2 regulates IL-17 and IL-21 production and the development of autoimmunity in mice[J].J Clin Invest,2010,120(9)：3280-3295.

[16]Hiroki J,Shimokawa H,Higashi M,et al.Inflammatory stimuli upregulate Rho-kinase in human coronary vascular smooth muscle cells[J].J Mol Cell Cardiol,2004,37(2)：537-546.

[17]Feng J,Zhang G,Hu X,et al.Estrogen inhibits estrogen receptor(ER)α-mediated Rho-kinase expression in experimental autoimmune encephalomyelitis rats[J/OL].Synapse,2013[2012-12-20].http：//onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/syn.21650//pdf.