比色法测定四味消扶散中总三萜酸含量

章红燕，周俐斐，林能明，芦柏震

(浙江省肿瘤医院，浙江 杭州 310022)

四味消扶散是根据我院临床经验方研制的抗肿瘤新药，由白花蛇舌草、炒山楂等4味中药组方，多年的临床观察表明，其对肿瘤患者手术、放射治疗、化学治疗期间的辅助治疗和治疗间歇、恢复期的固本治疗方面，疗效确切[1]。四味消扶散中含有的熊果酸、齐墩果酸等三萜酸具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞分化和凋亡等作用[2－3]。笔者采用分光光度法测定了四味消扶散中总三萜酸的含量，方法快速简便，稳定可靠。

1 仪器与试药

Agilent 8453型紫外分光光度仪;QC－250型超声波清洗器(上海超声波仪器厂)。四味消扶散(本院制剂室自制，批号分别为20061201，20070301，20070605);熊果酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号为110742－200415);冰乙酸，香草醛，高氯酸均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

取四味消扶散1包(28 g)，加入95%乙醇溶液500 mL，水浴加热回流提取2 h，放冷，滤纸减压过滤，滤液置500 mL量瓶中，加95%乙醇定容至刻度，摇匀;从中取出0.5 mL至10 mL容量瓶中，加95%乙醇定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液。精密称取熊果酸对照品适量，用无水乙醇制成每1 mL含100 μg熊果酸的对照品溶液。

2.2 香草醛—高氯酸显色条件

取供试品或对照品溶液，水浴蒸干后，加5%香草醛－冰醋酸0.4 mL，然后再加高氯酸1.0 mL溶解摇匀后，于60℃中加热10 min，冰浴冷却，加冰醋酸5.0 mL，摇匀即可。

2.3 波长选择

取供试品溶液和对照品溶液，按2.2项下条件显色反应后，于400～700 nm波长间进行扫描。结果供试品溶液与对照品溶液在544 nm处均有最大吸收峰，且空白对照无吸收，故选择544 nm作为测定波长。

2.4 方法学考察

精密度试验:取对照品溶液1 mL，按2.2项下条件显色反应后，于544 nm波长处测定吸光度6次，结果分别为0.616 68，0.618 29，0.617 13，0.616 17，0.615 34，0.614 77，RSD=0.21%(n=6)。

标准曲线绘制:分别取对照品溶液 0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50 mL，按 2.2 项下条件显色反应后，于 544 nm 波长处测定。以熊果酸对照品量(μg)为横坐标、吸光度为纵坐标，得回归方程 Y=0.005 2 X+0.121 8，r=0.993 6(n=6)。结果表明，熊果酸进样量在25～125 μg范围内与吸光度呈良好线性关系。

重现性试验:取四味消扶散(批号为200703011)3包，按2.1项下方法制备，取出0.5 mL按2.2项下条件显色反应，然后于544 nm 波长处测定吸光度，结果分别为 0.377 68，0.382 89，0.363 01，RSD=2.75% 。

稳定性试验:取重现性试验项下3份供试品溶液，分别于显色后 0，5，10，15，20，30 min 测定吸光度。结果显示，20 min 内RSD=0.37%，供试品溶液稳定。

加样回收试验:取已知含量的样品，分别添加熊果酸对照品，按上述测定条件测定，计算回收率。结果见表1。

表1 熊果酸加样回收试验结果(n=6)

2.5 样品含量测定

取3个不同批号的样品各3包，按2.1项下方法制备，取出0.5 mL按2.2项条件显色反应，然后于544 nm波长处测定 A，计算含量。结果见表2。

表2 样品中总三萜酸含量测定结果

3 讨论

香草醛－高氯酸比色法是测定中药材及制剂中总三萜酸含量较常用的方法，但影响因素较多。对试剂的用量、反应时间等因素考察后，最终确定了文中的反应条件。另外，冰醋酸、香草醛、高氯酸等试剂的含水量会使最大吸收波长发生位移，并对测定灵敏度产生影响。

总三萜酸在乙醇、甲醇等极性有机溶剂中有较好的溶解度。试验中比较了加热回流提取1，2，3 h和超声提取0.5 h的提取率，结果显示四味消扶散加热回流提取2 h与3 h总三萜酸的得率基本一致，并显著高于超声提取0.5 h，说明加热回流提取2 h即可提取完全。

样品含量测定结果表明，总三萜酸在四味消扶散中的含量可达3%以上，可能是其抗肿瘤主要成分之一。

[1]Lu BZH，Ling NM，He XB，et al.Analysis of Hedyotic diffusa in our hospital for anti－ tumor therapy[J].China Journal of Chinese Materia Medica(中国中药杂志)，2006，(18):1 550 －1 552.

[2]Chiang LC，Chiang W，Chang MY，et al.Antileukemic activity of selected natural products in Taiwan[J].American Journal of Chinese Medicine，2003，31(1):37 －46.

[3]Fernandes J，Castilho RO，da Costa MR，et al.Pentacyclic triterpenes from Chrysobalanaceae species:cytotoxicity on multidrug resistant and sensitive leukemia cell lines[J].Cancer Letters，2003，190(2):165 － 169.