鸡胚胎干细胞的体外培养和鉴定

何文俊 刘红 叶玲玲 李世崇 王启伟 陈昭烈

胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）是一种未分化的具有自我更新能力的细胞，在胚胎发育和基因功能研究、药物筛选和新药开发、转基因动物种质培育以及组织修复和细胞治疗等领域显示出巨大优势和应用前景［1-3］。自1996年Pain等［4］首次在体外长期培养禽类胚胎干细胞（chicken embryonic stem cells，cESCs）获得成功以来，分离和培养禽类多能干细胞已成为转基因禽培育、珍稀禽类保种和脊椎动物早期发育研究模型制备的重要前提［5-7］。随着近年来由禽类胚胎干细胞衍生细胞系被越来越多地用作治疗性抗体和病毒疫苗的生产系统，禽类胚胎干细胞分离、培养和建系再次成为干细胞研究和应用的热点［8-10］。

由于禽类具有独特的生殖生理特点和胚胎发育过程，鸡的受精卵排出体外时处于胚胎发育的X期。X期胚胎中的胚盘细胞具有发育的全能性，且能参与各种组织的形成，从X期胚胎中可能会培养出多能性细胞。本研究从X期的鸡胚中分离胚盘细胞，旨在获得典型的呈集落生长的鸡ESCs克隆并在体外培养体系中保持未分化状态。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 白来杭鸡种蛋购自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所。昆明白孕小鼠（孕期14-16d）购自军事医学科学院实验动物中心。

1.1.2 主要试剂 高糖DMEM、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、鸡血清、100×非必需氨基酸和TRIzol购自Invitrogen公司；胰蛋白酶、HEPES购自Hyclone公司，明胶、β-巯基乙醇和DAPI购自Sigma公司；白血病抑制因子（LIF）和100×核苷购自Millipore公司，丝裂霉素C和链霉蛋白酶购自Roche公司，乙二胺四乙酸二钠（EDTA）购自北京化学试剂公司，bFGF、hIGF-1、mSCF和hIL-11购自Peprotech公司，抗SSEA-1单克隆抗体购自Santa Cruz生物技术公司，抗Oct-4多克隆抗体购自Cell Signaling公司，RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司。

1.1.3 仪器设备 CO2培养箱购自Thermo Forma公司，超净工作台购自上海力申科学仪器有限公司，超纯水制备机购自MILLI-Q公司，倒置相差显微镜和荧光显微镜购自Nikon公司，激光扫描共聚焦显微镜购自Zeiss公司，PCR仪购自Biometra公司，电泳仪购自北京市六一仪器厂，凝胶成像采集系统购自United-Bio公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠胚胎成纤维细胞滋养层的制备 处死孕期14-16d的昆明白孕小鼠，无菌条件下取出胚胎后去其头部和内脏，PBS充分洗涤，将其剪碎后用胰酶溶液（0.25％胰酶+0.04％ EDTA）分阶段消化，适时终止消化，吸取上层悬液并离心收集细胞，计数后以5×105cells/mL重悬于小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）生长培养基（DMEM，10％ FBS），接种于100mm组织培养皿中，37℃孵育至细胞长满。细胞传至第2代时，用10μg/mL的丝裂霉素C处理2h，PBS冲洗3次，加入适量胰酶溶液消化，收集细胞，重悬于MEF生长培养基中，以104cells/cm2接种于0.1％明胶包被的24孔培养板中。

1.2.2 X期胚盘细胞的分离 参照文献［11，12］使用纸环法分离获得胚盘细胞。取新鲜的未孵化的白来杭鸡种蛋，新洁尔灭浸洗后再用75％酒精消毒。在超净工作台内小心剥去蛋壳，将卵黄从蛋清中分离出来。辨别卵黄上的胚盘位置，使胚盘朝上放置，剪一小块正方形的滤纸，在其中央打一个圆形的孔，并将其轻轻放在卵黄上，使胚盘暴露在孔的中央。在滤纸周边剪开卵黄膜，然后将滤纸从卵黄上轻柔地提起，将贴附有胚胎的滤纸缓慢垂直浸入PBS中，清除胚胎上的卵黄，分离整个胚盘，将其收集到离心管中，PBS漂洗，1000r/min离心5min，收集细胞。

1.2.3 cESCs的培养 参照van de Lavoir等［11］和陈胜峰等［13］的方法并加以改进。X期胚盘细胞用ESC生长培养基（DMEM、10％ FBS、2％鸡血清、1％非必需氨基酸、1％核苷、10mmol/L HEPES、0.16mmol/L β-巯基乙醇、100U/mL 青霉素 /链霉素、10ng/mL bFGF、20ng/mLhIGF-1、2ng/mLmSCF、2ng/mLhIL-11、1000U/mL LIF）重悬，机械吹打后以1个胚盘/cm2的细胞密度接种到MEF滋养层上。每天换液，细胞长满时，用0.025％链霉蛋白酶消化传代，PBS漂洗后接种于新鲜的MEF滋养层上。

1.2.4 cESCs的鉴定

1.2.4.1 碱性磷酸酶（AKP）染色 细胞用PBS漂洗，冷的4％多聚甲醛固定15min，再用底物缓冲液（100mmol/L Tris-HCl pH9.5，50mmol/L NaCl，50mmol/L MgCl2，0.1％ Tween-20）平衡，然后加入染色液（75mg/mL NBT溶于70％ DMF，50mg/mL BCIP溶于100％ DMF，染色前分别取45μL NBT溶液和35μL BCIP溶液溶于底物缓冲液），37℃孵育30min。PBS漂洗后倒置显微镜下观察结果。

1.2.4.2 免疫荧光染色 PBS漂洗细胞，然后加入冷的4％多聚甲醛固定15min。PBS漂洗，加入0.3％Triton X-100作用30min。PBS漂洗，加入0.5％ BSA封闭20min。吸掉封闭液，加一抗SSEA-1（1∶50）或Oct-4（1∶50），4℃孵育过夜。PBS漂洗，加二抗FITC标记的羊抗小鼠或兔IgG（1∶50），室温避光孵育1h。PBS漂洗，0.1μg/mL DAPI复染细胞核15min，荧光显微镜下观察。

1.2.4.3 RT-PCR TRIzol裂解细胞，进行总RNA的提取，具体操作参照TRIzol试剂说明书。RT-PCR反应总体系50μL，RNA样品各1μg，引物序列见表1，条件为50℃反应30min。接着进行PCR扩增，程序为：94℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，10个循环；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，10个循环；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，20个循环；最后再72℃延伸5min。取5μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪保存图像。

表1 RT-PCR引物序列

2 结果

2.1 cESCs的培养

鸡Ⅹ期胚盘细胞在MEF滋养层上培养24h，倒置显微镜下可见散在分布的圆形或椭圆形细胞集落，其上附有卵黄颗粒和脂滴（图1-A）；培养4d后，细胞集落明显增大、与MEF的边界清晰，形成类似早期胚胎组织的拟胚体，集落内的cESCs彼此紧密接触，界限不清（图1-B）。cESCs在体外培养的第2-4d增殖旺盛，此后逐渐进入平台期，原代cESCs的体积较小，细胞核相对较大，胞质相对很少。

图1 在MEF滋养层上生长的原代cESCs（100×）

2.2 cESCs的鉴定

2.2.1 AKP染色 AKP的存在是细胞保持未分化状态的一个重要标志。采用BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒检测集细部落中cESCs的AKP表达，染色阳性的细胞呈棕红色，阴性细胞不着色，证实集落中大部分的细胞保持未分化状态（图2）。

图2 原代cESC的AKP染色鉴定（100×）

2.2.2 免疫荧光染色 SSEA-1（stage-specific embryonic antigen 1）是早期胚胎阶段特异性细胞表面抗原，转录因子Oct-4可能是脊椎动物不同发育阶段多潜能细胞所特有的特异调控分子，是公认的胚胎干细胞相关标志。ESCs特异性标志的免疫荧光染色显示原代cESCs表达SSEA-1（图3-B）和转录因子Oct-4（图3-D）。激光共聚焦显微镜（图4）显示，SSEA-1表达于细胞膜上，Oct-4表达于细胞质中。

图3 原代cESC的免疫荧光染色鉴定（100×）

2.2.3 cENS-1的RT-PCR分析 鸡胚胎正常干细胞基因（chicken embroynic normal stem cell gene，cENS）是cESCs和鸡早期胚胎特异表达的基因家族，包括cENS-1、cENS-2和 cENS-3。cENS-1的 RT-PCR分析（图5）显示，原代cESCs和X期胚盘细胞表达cENS-1，鸡胚成纤维细胞不表达cENS-1。

图4 原代cESCs的激光扫描共聚焦显微镜观察（1000×）

图5 原代cESCs的RT-PCR鉴定

3 讨论

cESCs大多数来源于X期未孵化的明区胚盘细胞［11］。胚盘提取时，在保证胚盘完整的情况下应尽快将其取出并放入到PBS中以除去卵黄和卵黄膜，得到用于培养的胚盘细胞。刚取出的胚盘细胞间粘连作用并不是很强，在原代分离时不易用胰蛋白酶消化，一般借助于机械吹打就可以将细胞分离开来。而经一段时间的体外培养后细胞间的粘连作用增强，此时需要借助胰蛋白酶的作用同时辅以机械剥离将cESCs分散［14，15］。在cESC的传代过程中，一般将细胞集落分散为20-40个细胞的小细胞团并以一定密度接种，有助于发挥细胞间的协同作用，防止细胞分化，促进克隆生长。本研究在cESC的传代过程中用链霉蛋白酶替代胰酶消化传代cESC，不需辅以机械剥离或过度机械吹打就能有效地分散cESC。

cESCs体外培养的关键是保证其维持未分化状态，常用的方法是合理设计基础培养基、采用滋养层细胞以及添加细胞因子。cESCs对能量与营养的要求很高，故选用高糖DMEM为基础培养基，同时在培养基中添加L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、非必需氨基酸、核苷酸等物质。滋养层在cESCs的培养过程中起着重要的作用，既可促进cESCs贴壁生长，又可分泌各种因子抑制 cESCs分化［16，17］。用于制作滋养层的细胞主要有STO细胞、MEF、同源动物胚胎成纤维细胞等。小鼠ESCs成功建立以来，MEF被广泛用于多种动物的ESCs培养，很多培养基和细胞因子的添加都是针对MEF设计的。此外，cESCs的生长还需依赖特定的生长因子和细胞因子，如bFGF、SCF和LIF等。bFGF和SCF可刺激细胞增殖并防止细胞分化［18，19］。LIF因子是目前广泛采用的一种细胞分化抑制因子，对小鼠ESCs的生长至关重要，在维持cESCs的多能性特征中也是必需的［17］。另一个细胞因子LIF的家庭成员IL-11，也有利于鸡胚盘细胞维持cESCs样特征［19］。

基于以上考虑，本研究采用传至2代并经丝裂霉素C处理的MEF为滋养层，在高糖DMEM培养基中添加10ng/mL bFGF、20ng/mLhIGF-1、2ng/mLmSCF、2ng/mLhIL-11和1000U/mL LIF等细胞因子组成的cESCs培养体系mL。与陈胜峰等［13］和陈致胜等［20］的同类研究相比较，这一培养体系除采用MEF替代鸡胚成纤维细胞作为滋养层外，还有包括hIGF-1和hIL-11在内的种类更为丰富的细胞因子。研究结果表明这一培养体系能有效地支持cESCs的体外生长并保持未分化状态。

ESCs的特点是细胞小而圆，排列紧密，核质比高，并具有较强的内源性AKP活性。本研究所分离培养的cESCs也呈集落样生长，集落中的细胞小而圆，排列紧密，同样具有较高的内源性AKP活性。SSEA-1表面抗原和转录因子Oct-4的存在是cESCs保持未分化状态的另一个重要指标［21］。本研究所分离培养的cESCs表达SSEA-1和Oct-4，表明其具有cESCs表型。cENS是cESCs有别于其他动物细胞的特异性基因家族［22］。cENS-1的RT-PCR分析进一步证实，本研究所培养的cESCs还表达鸡cENS-1。以上结果表明，来源于X期鸡胚的胚盘细胞的cESCs具有与其他脊椎动物共享某些ESCs特征，物种间胚胎祖细胞的这些抗原决定簇是高度保守的。

4 结论

从鸡X期胚胎中分离胚盘细胞，在MEF为滋养层和高糖DMEM为基础培养基并添加10ng/mL bFGF、20ng/mLhIGF-1、2ng/mLmSCF、2ng/mLhIL-11和1000U/mL LIF等细胞因子的培养体系中获得典型的呈集落生长的cESCs克隆。cESCs克隆具有较高的内源性AKP活性并表达多能性标志SSEA-1和Oct-4。采用培养体系能有效的自鸡X期胚胎分离cESCs并维持其在体外生长并保持未分化状态。

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