黑曲霉葡萄糖氧化酶高产基因工程菌研究进展

刘瑜 李丕武

1 葡萄糖氧化酶简介

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）最早在黑曲霉的提取物中发现［1］，系统名称为β-D-葡萄糖：氧1-氧化还原酶（EC 1.1.3.4）。它能够催化β-D-葡萄糖被氧气氧化成葡萄糖酸-δ-内酯，并生成过氧化氢［2］。生成的葡萄糖 -δ-内酯随后自发水解［2］或者在内酯酶的作用下水解成葡萄糖酸［3］。相关反应，如图1所示。

图1 葡萄糖氧化酶酶促反应［4］

GOD应用广泛，可用于葡萄糖传感器制造［5］、面粉添加剂［6］、葡萄糖酸及其盐生产［7］和生物燃料电池［8］等领域。因此，寻求更有效的GOD的生产方法具有重要的现实意义。目前生产GOD的微生物有黑曲霉（Aspergillus niger）［9］、尼琦青霉（Penicillium amagasakiense）［10］、变幻青霉（Penicillium variabile）［11］和软毛青霉（Penicillium puberulum）［12］等，其中以黑曲霉最为重要。

2 黑曲霉GOD结构性质简介

黑曲霉GOD含有两个相同的亚基，两个亚基通过两个二硫键相结合［13］，每个亚基含有一个紧密非共价结合的 FAD 分子［14］。Swoboda 和 Massey［15］测得相对分子质量为18.6kD，热变性或化学变性（8mol/L尿素）后测出每分子含有1个巯基和两个二硫键，酶分子糖含量为16.5％（±0.8％），如此高的糖含量使得黑曲霉GOD具有很多不寻常的性质：100℃时不发生沉淀；对0.75％的十二烷基硫酸钠（SDS）稳定；5％的三氯乙酸只能使其缓慢沉淀；在水中的溶解度较高，需要较高浓度的盐才能沉淀（80％-90％ 硫酸铵）。Nakamura和 Fujiki［16］测定其含有的糖主要是甘露糖、葡萄糖和己糖胺。Kalisz等［17］测得最适pH5.5-6.0，且糖链对酶的结构、稳定性和活力不起主要作用。1989年，Kriechbaum等［18］首先克隆了黑曲霉NRRL-3的GOD基因，该基因由1 815个碱基对组成，编码一个亚基的605个氨基酸残基。由于成熟的酶的一个亚基含有584个氨基酸残基，因此确定有21个氨基酸残基组成了信号序列。1993年，Hecht等［19］得到了分辨率为2.3 Å的部分脱糖基的黑曲霉GOD晶体结构模型。1999年，Wohlfahrt等［20］获得了黑曲霉GOD1.9Å的结构，从结构上解释了酶对底物的专一性、D-葡萄烯糖的竞争性抑制、卤素离子的抑制作用等性质。2011年，Kommoju等［21］得到了该酶分辨率为1.2Å的结构，并以氯离子代替氧探索了氧激活位点。

3 黑曲霉GOD生产进展

3.1 黑曲霉发酵生产GOD

黑曲霉发酵是传统的GOD生产方法，也是目前为止被研究得最多的方法。近年来研究成果主要有：Liu等［22］利用台式生物反应器对黑曲霉发酵生产GOD进行了响应面优化，并对菌丝体生长、GOD的生产和葡萄糖的消耗进行了模拟，得到的模拟结果能够较好地与试验结果吻合。 Mirón等［23］研究了碳源和氮源对黑曲霉发酵生产GOD的共同作用，着重针对于NP2和N2P交互作用进行了因素试验，结果表明无机氮源（硝基氮）比有机氮源（蛋白胨）更适合产酶，有机氮源能够促进菌体生长而不利于葡萄糖转化成葡萄糖酸；确定了最佳碳源和氮源比例，使酶活从1.8U/mL提高到12U/mL。Gera等［24］研究了葡萄糖、蔗糖和棉子糖对黑曲霉NRRL326产酶的影响，表明蔗糖效果最好（4.5U/mL），但当浓度大于20g/L时对产酶有明显的抑制作用。Bankar等［25］分两步对产酶条件进行了优化，最终确定碳酸钙、蛋白胨和硫酸镁为显著因素，并使酶活力从0.009 93U/mL提高到了2.05U/mL，培养时间从96h降低到72h。Khattab和Bazaraa［26］采用先诱变后原生质体融合的方法以黑曲霉FS-3（发酵液酶活力15.9U/mL）为出发菌株筛选高产菌株，得到了融合子C-18，胞外酶活力达62.7U/mL。

从以上资料可以看出，目前的研究集中于新菌株的筛选以及方法的优化，并获得发酵过程中的动力学模型。由于黑曲霉产酶不高，且大部分的酶存在于细胞壁和胞内［27］；分离纯化困难，而且该方法经过多年的研究，产量提高的潜力相当有限，因此需要利用新的方法提高GOD的产量。

3.2 基因工程菌发酵生产GOD

利用基因工程的方法解决黑曲霉发酵产酶不高的问题，策略有两种：第一是通过增加黑曲霉中的GOD基因的拷贝数来增加产量；第二是对GOD基因进行异源表达，使基因摆脱原来调控系统的限制，在人为构建的表达盒中得到高效的表达。

3.2.1 黑曲霉基因工程菌的构建与发酵 丝状真菌被用来表达内源和外源蛋白具有以下优势：真菌能够大量的分泌蛋白，可以避免蛋白在细胞内积聚可能会对细胞造成毒害的问题。并且，由于其发酵技术较为成熟，丝状真菌可以在廉价的培养基中大量的生长，在优化的生长条件下，自身蛋白能达到较高的分泌水平；另外，作为一种真核生物，其所具有的翻译后加工机制在生产需要复杂翻译后修饰的蛋白方面具有额外的优势。最后，很多重要的工业丝状真菌如黑曲霉、米曲霉、里氏木霉、顶头孢霉和产黄青霉本身为GRAS微生物，在生产药用蛋白和食品用蛋白时具有良好的生物安全性［28］。

目前，在产GOD黑曲霉基因工程菌构建方面已经完成的主要工作如表1所示。

表1 已报道的产GOD基因工程黑曲霉的构建

人们还对黑曲霉工程菌的培养做了很多研究工作。 El-Enshas等［32］研 究 了 NRRL-3（GOD3-18）在摇瓶和搅拌罐式反应器培养时菌丝形态及其与GOD分泌之间的关系发现，小而致密的菌丝球有利于GOD的分泌，推测原因是小的菌丝球有利于营养物质的传递。摇瓶培养时形成的菌丝球明显分层并中空，而搅拌罐式反应器中菌丝球的形成分为两步。随后他又研究了非葡萄糖碳源对NRRL-3（GOD3-18）中GpdA启动子控制下GOD生产的影响，指出在碳源为葡萄糖、果糖和木糖时，GpdA启动子控制下的GOD的合成同细胞生长严格耦联；在5 L搅拌罐式反应器发酵120h后，木糖作为碳源时GOD总活力、比活力和胞外比例分别为626.0 μKat/L、42.0 μKat/CDW（CDW：细胞干重）和87.0％，优于或接近使用葡萄糖为碳源的水平（234.0 μKat/L、48.0 μKat/CDW和89.0％），并且不形成葡萄糖酸［33］。

提高黑曲霉GOD基因的剂量能够使GOD表达水平相对出发菌株有较大提高，但是最终效果同传统菌种改造方法差别不大，对于工业应用缺乏足够吸引力。其可能原因是丝状真菌表达系统不够成熟，需要丝状真菌遗传学和细胞生物学理论的发展。

3.2.2 酿酒酵母表达黑曲霉GOD 酿酒酵母是应用最早的真核表达系统，其具有的一些特点使其成为表达工业和医学所用外源蛋白的重要工具。首先，作为一种公认安全的微生物，将其用于药物蛋白的生产已为人们所高度接受。相比之下，大肠杆菌表达的外源蛋白可能会含有内毒素，哺乳动物细胞可能会含有致瘤或病毒DNA。其次，酿酒酵母可以在简单的培养基上快速的生长，并达到很高的细胞密度。最后，其遗传学特性比其他任何真核生物的研究都更加透彻，可以像大肠杆菌一样方便的进行操作。酿酒酵母是第一种用于黑曲霉GOD外源表达的微生物，早在1990年，Frederick等［34］首先用酿酒酵母GRF181表达了黑曲霉GOD基因。已发表的以酿酒酵母为黑曲霉GOD表达宿主的主要文献列于表2。

表2 酿酒酵母表达黑曲霉葡萄糖氧化酶的研究概况

为了提高酶的产量，很多学者对酿酒酵母基因工程菌的培养进行了详细研究。从1998年-2001年，Kapat等［41-44］连续发表了4篇论文探讨产黑曲霉GOD基因工程酿酒酵母培养的问题。在首先发表的论文中研究了不同的补糖（包括葡萄糖和半乳糖）策略对重组酿酒酵母产GOD的影响，恒速流加半乳糖的策略下产酶达到最高，达154U/mL，比分批式操作提高了52％［41］。之后运用恒定pH反馈补料分批式发酵策略使胞外酶活力提高到了199U/mL，比普通分批式发酵提高了1倍多，比非反馈控制的补料分批式发酵（154U/mL）提高了28％［44］。随后他们的试验证实了连续补加半乳糖不适合重组黑曲霉GOD发酵：虽然96h后酶活力达到164U/mL，但是会形成过量的乙醇，并且还会造成表达载体的不稳定［43］。2001年发表的论文中，他们虽然证明了搅拌速率对酶产量有直接的作用，但是建立kLa与酶产量之间的关系的工作没有成功［42］。

综合上述文献，有两点需要引起注意：第一，使用GOD本身的信号肽序列可以取很高的分泌水平，甚至比常用的分泌效率已经很强的强酿酒酵母α-factor信号肽序列更高［34］；第二，不同的酿酒酵母作为表达宿主时表达水平相差很大，De Baetselier等［45］在其论文中也指出，在利用相同的表达载体表达相同的黑曲霉GOD基因时，不同的酿酒酵母菌株表达水平高者和低者可相差百倍。随着将来对这些现象内在机制的深入研究，必将使得人们对外源蛋白的表达机制的认识得到进一步的深化。

同其他主要表达体系相比，使用酿酒酵母进行表达虽然是较早的方法，但是取得的效果较新兴的表达体系相差并不很多［36，46，47］，其原因有待深入探讨；酿酒酵母为GRAS生物，重组酶的生物安全性也较好。缺点在于目前大部分采用的均为附加体载体，这种载体的优点是拷贝数高，但是在发酵过程中容易丢失，造成菌种生产性能的不稳定。整合型载体稳定性好，但是目前表达水平还不尽如人意。3.2.3 巴斯德毕赤酵母表达黑曲霉GOD 巴斯德毕赤酵母是一种成熟的真核微生物外源蛋白表达平台，具有以下特点［48］：生长迅速并培养廉价；作为一种真核生物，具备翻译后蛋白加工能力，在酵母中合成的蛋白质更有可能正确的加工、折叠与正确的组装成具有功能的分子。同酿酒酵母和其他酵母相比，毕赤酵母不倾向于发酵糖和其他碳源，而更倾向于利用它们进行有氧呼吸生长，这极大地有利于高细胞培养：因为它只是简单的把碳源转化成生物量，不产生大量的有毒的发酵产物，如乙醇。重组蛋白的产量通常同生物量成比例，因此巴斯德毕赤酵母易于进行高密度培养是一个主要的优势。另外，巴斯德毕赤酵母能够以甲醇为唯一碳源和能源进行生长，在这种条件下，醇脱氢酶（AOX）和二羟丙酮合酶（DHAS）可以占细胞蛋白的近30％，并且这两种蛋白的水平的调控主要是在转录水平上的，因此使用其启动子可以驱使外源基因得到较高水平的表达。近年来关于利用巴斯德毕赤酵母表达黑曲霉GOD的主要报道，如表3所示。

表3 巴斯德毕赤酵母表达黑曲霉葡萄糖氧化酶的研究概况

毕赤酵母表达黑曲霉GOD在发酵罐中可以达到很高水平［46］，但在摇瓶中表达水平不高，这是由于毕赤酵母本身的特性所致［48］。在某些情形下，重组酶的特性还有所改善，如周亚凤［49］报道重组GOD的比活、转换数kcat值及二级动力学常数 kcat /Km比活明显地高于商品酶，黄亮［51］报道重组酶最适温度较黑曲霉GOD提高了8℃。但是，巴斯德毕赤酵母为宿主表达黑曲霉GOD也还存在一些缺点：首先是巴斯德毕赤酵母本身不属于美国食品药品管理局（FDA）所认证的GRAS微生物，表达的重组酶存在生物安全性问题，限制了在食品方面的应用；其次，诱导型表达过程中需要甲醇诱导，而甲醇是有毒易燃品，不但给生产人员的安全和消防安全带来隐患，而且在酶的分离纯化过程中带来额外的麻烦，特别是将GOD用作食品添加剂时。组成型表达可以避免这个问题，但是酶活力很低［52］。因此将巴斯德毕赤酵母表达系统应用于黑曲霉GOD的工业化生产还存在很多问题亟待解决。酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母在表达黑曲霉GOD方面的比较如表4所示。3.2.4 其他表达系统在表达黑曲霉GOD 其他表达系统在黑曲霉GOD表达方面应用的不多。安玉麟等［53］用原核生物大肠杆菌表达了黑曲霉酶GOD，得到的转化子的总蛋白同抗黑曲霉GOD血清有较强的免疫反应。在真核表达方面，Whittington等［29］通过基因工程手段使不产GOD的构巢曲霉显著的表达了黑曲霉GOD。Hodgkins等［54］使用多型汉逊酵母表达了黑曲霉GOD，胞外酶活力达到445U/mL（2.25g/mL），胞内酶活为 76U/mL（0.38g/mL），达到了很高的水平。2006年，母敬郁等［55］以瑞氏木霉为宿主进行表达，诱导5d后酶活为25U/mL。2010年，Rocha［56］发表了以马克斯克鲁维酵母表达GOD的结果，当以附加体表达系统表达时，胞外酶活最高为 1552U/g DCW（DCW：Dry Cell Weight）。同年，Dowdells等［57］在土曲霉中表达了黑曲霉GOD，并用转化子进行葡萄糖糖酸的生产。

表4 表达黑曲霉GOD酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母基因工程菌的比较

3.2.5 黑曲霉GOD基因的改造 定向进化已经成为获得高效生物催化剂的重要手段，其主要原理是向蛋白编码基因中引入随机突变并利用高通量筛选手段筛选蛋白突变体，进而选择出其对应的编码序列以进行下一步的突变与筛选，不断的重复这一过程使得有益突变得到积累。定向进化的过程由几个步骤循环进行：产生随机的基因文库；在适宜的宿主中表达；筛选突变酶的文库，寻求具有感兴趣的性质的突变体［58］。手段有 DNA shuffling［59］，易错PCR［60］和交错延伸过程［61］等。

刘丹等［62］通过两轮易错PCR，从3000多个突变子中得到3个酶活提高的突变株，成功使比活力提高到原来的3-4倍。Prodanovic等［63］采用超高通量筛选从含有105个突变体的107个细胞中得到催化活力提高2倍的突变体K150R。Yu等［64］利用定向进化的手段得到了更适用于酶电极的突变体B11-Gox。Holland等［65］通过对黑曲霉GOD基因进行饱和突变发现，当132位的苏氨酸突变成丝氨酸时，特异性常数kcat/Km从8.39mmol/L/S变为23.8mmol/L/s，同时对底物亲和力仅仅降低了3％。对于GOD的定向进化还处于起步阶段，发展潜力很大。

4 展望

4.1 深入研究宿主蛋白表达分泌机制，通过基因工程手段改良现有表达系统

不同的表达系统表达黑曲霉GOD的水平的差别相当大［31，36，47，54，55］，并且用相同的载体转化同一种生物的不同菌株，得到的外源蛋白的表达水平也有相当大的差别［45］，宿主细胞蛋白表达与分泌机制的不同是导致该结果的重要的原因。目前，一些主要的外源蛋白表达宿主均已经完成了基因组测序［66-69］，对这些微生物的蛋白表达、加工、分泌机制的研究也在进一步的深入。通过对微生物原有分泌表达机器的改造，可以获得更适用于蛋白生产的菌株。因此，需要从基因组水平乃至蛋白质组水平对外源蛋白分泌表达机制深入的进行研究，并以分子生物学操作获得更合适的宿主菌株，使现在发展较成熟的表达系统得到进一步的发展。

4.2 开发新型表达载体与宿主

开发新型的表达载体和宿主也是解决外源蛋白表达水平不高的有效途径。为了解决附加体载体的不稳定性和整合型载体拷贝数少的问题，Lopes等［70，71］开发了rDNA整合型载体，每个细胞中整合的拷贝数可达100-200个，并且具有相当的稳定性。

4.3 蛋白质定向进化

通过高通量筛选突变体，积累有益突变，可以得到比活力更高的酶，或者具有其他优良特性的酶，加强酶的耐热性、稳定性等。

4.4 过程优化

包括诱导剂［43］、过程条件［42］、培养基成分［33］等。通过这些可以增加酶产量，促进酶的分泌［32］，降低工程菌自身的蛋白酶活性［72］等。另外，反应器培养时表达水平有可能与摇瓶不同，因此在放大过程中也需要进一步的优化条件［72］。

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