青枯菌种内分型研究进展

蔡刘体 汪汉成 刘艳霞 曹毅 袁赛飞 赵准备 石俊雄

青枯菌（Ralstonia solanacearum）是一种土传性的细菌性病原菌，属于革兰氏阴性细菌，广泛分布于热带、亚热带及一些温带地区，它具有广泛的寄主，可以侵染 50多个科的 200多种植物［1］，包括烟草（Nicotiana tabacum）、芝麻（Sesamum indicum）、花生（Arachishypogaea）、大豆（Glycinemax）、萝卜（Raph-anus sativus）等多种农作物以及一些贵重药材和花卉植物，严重危害一些农作物的产量，其中马铃薯、番茄、烟草等茄科作物受害最为严重［2］。

青枯菌是一个复杂的菌种［3］，寄主范围宽、分布广泛，具有高度的变异性和适应性，不同地域或不同寄主的菌株间有明显的变异和分化现象［3，4］，而且青枯菌生理生化致病途径众多［5］。为了探索青枯菌引起的病害、青枯病害的流行规律，更好地指导青枯病害的防控及经济作物的抗病育种，国内外研究者开展了青枯菌内亚分类或菌系分群的研 究 工 作。 前 人 从 生 理 小 种（races）［5］、 生 化型（biovars）［6］、 血 清 型（serotypes）［7］、 溶 源 型（lysotypes）［8］、脂肪酸型［9-11］、基因型（genetypes）［12］、种系型［3］等多方面对种内分型进行研究，目前大多数认同的分型方法主要有生理小种、生化型和种系型（phylotypes）3种分型方法。本文综述青枯菌种内分型的主要研究进展，并对不同的分型进行比较，期望为烟草青枯菌系的构成和遗传多样性分析，以及烟草与青枯菌互作研究提供参考。

1 青枯菌种内分型方法

1.1 生理小种

青枯菌具有广泛的寄主，按照不同来源的青枯菌株系对不同植物种类的致病性差异，早在20世纪60、70年代，Buddenhagen等［13-17］制定了青枯菌生理小种的划分方法，把青枯菌划分为5个生理小种［18］：（1）生理小种 1（race1）：可侵染茄科植物和其他科植物的青枯菌；（2）生理小种2（race2）：只侵染香蕉（Musa paradisiaca）、大蕉（Musa sapientum L.）和Heliconia的青枯菌；（3）生理小种3（race3）：只侵染马铃薯，偶尔侵染番茄和茄子的青枯菌；（4）生理小种4（race4）：只对姜（Zingiber officinale）有很强致病力的青枯菌；（5）生理小种5（race5）：特异性侵染桑属植物的青枯菌。按照寄主把青枯菌分为不同的生理小种对作物抗病育种非常有用，而且目前青枯菌生理小种的划分仍然延用该方法，但是由于青枯菌寄主范围广泛，按照寄主划分的方法工作量大，较耗费时间［19］，而且有同一青枯菌株系同时被划归到几个生理小种的情况出现。

1.2 生化型

青枯菌的另一个亚分类系统主要是由Hayward等［20，21］提出的，他们根据青枯菌对3种双糖（麦芽糖、乳糖和纤维二糖）和3种己醇（甘露醇、山梨醇和半乳糖醇）氧化产酸能力的差异，将从各大洲收集的185个青枯菌分为4个生化型：生化型1（不能氧化3种双糖和3种己醇）、生化型2（只能氧化3种双糖，不能氧化3种己醇）、生化型3（能氧化3种双糖和3种己醇）、生化型4（只能氧化3种己醇，不能氧化3种双糖）。Hayward等［22］在此基础上，依据青枯菌利用硝酸盐还原反应和利用硝酸盐产生气体情况，将青枯菌划分为6个生化型。表1显示按照对糖、醇以及硝酸盐的利用情况，将青枯菌划分为5个生化型，但根据其对海藻糖、肌糖、D-核糖以及果胶酶的利用情况，把生化型2分为生化型2A和生化型2T/2N（表2），其中生化型2A包括有RFLP分型的 26组和27组。青枯菌株系生化型的研究报道目前仍沿用［23］，邹阳等［24］采用该方法分析了中国重庆地区烟草青枯菌的生化型。该方法分析青枯菌的生化型相对而言，工作量较小且较短时间获得结果，但是也有出现个别青枯菌株系不好划分的情况［25］。

1.3 种系型（或称为演化型）

随着分子生物学和分子进化技术的发展，青枯菌研究者在青枯菌生理小种和生化型划分的基础上，期望了解青枯菌的种系结构、遗传背景、地理起源及其与复杂群体的相关性，Fegan和Prior［3］共同提出了以亲缘关系为基础的划分体系，将青枯菌分成4个种系型，每一个种系型又继续分成更小的群体，称为序列型（sequevars）。在此划分框架中，种系型定义为菌株的16S-23S rRNA 基因间间隔区（ITS），hrp（超敏反应蛋白基因）和egl（内切葡聚糖酶基因）的序列数据，通过系统发育分析显示为一个单系群。按照这种划分，每个种系型反应了菌株的地理起源，其中种系型Ⅰ和Ⅱ分别由亚洲和美国菌株组成，种系型Ⅲ的成员由非洲菌株组成，种系型Ⅳ包括来自印度尼西亚和澳大利亚的 R.syzygii和 BDB［3，18］。青枯菌种系型是根据青枯菌特异性引物，通过PCR扩增的带型特征来划分，青枯菌种系型的划分方法见表3，一个青枯菌株系的种系型可以基于IST区间序列信息设计引物的基础上，通过复合PCR快速的鉴定出来［3］。徐进等［26］采用复合PCR检测青枯菌种系型的分析方法，分析了福建主要烟区的45个烟草青枯菌株系都属于种系型I；潘哲超等［27］基于内切葡萄糖酶基因系统发育学的分析，结果表明来自福建和部分贵州的62个烟草青枯菌株系均归属于青枯菌亚洲分支（种系型I）。

表1 青枯菌不同生化型的划分［20］

表2 青枯菌生化型II的亚型划分

表3 基于ITS区设计的用于青枯菌种系型分析的特异性条带PCR扩增的引物信息［3，18］

2 青枯菌分型的比较

与生理小种和生化型划分相比较，种系型的划分框架似乎能更准确的反映出目前已知青枯菌的遗传多样性和复杂性。在生理小种划分框架中，生理小种1（R1）定义为“可侵染茄科植物和其他科植物”的青枯菌株系包含非常宽泛，从种系型看，可以归为R1的包含有种系型I-种系型IV的青枯菌株系；而生理小种2（R2）和生理小种3（R3）的寄主范围很窄，在生理小种划分框架中所反映的遗传多样性也比较窄，R2和R3在种系型框架中都是属于种系型II。在生化型划分框架中，生化型1和2T青枯菌株系包含有4个种系型中的3个，而且在青枯菌株系划分中，仅仅知道其是生化型1和2T也不能提供该株系的更多信息。

种系型划分框架，首先基于对菌株的16S-23S rRNA 基因间间隔区（ITS），hrp和egl基因的序列数据分析，通过系统发育分析定义单系群，然后从基因序列水平上来反应每个种系型与菌株的地理起源和遗传信息的对应关系，分为4个种系型。划分框架中每个种系型中都可以细分为序列型，使其成为开放性的划分框架，有利于对新发现的青枯菌株系进行划分，也有利于其自身信息和划分框架的完善。然而，无论是生理小种、生化型还是种系型的划分框架，都不能直接反映出青枯菌株系的致病性和致病力，许多研究表明采用的种下分型的分析方法与青枯菌的致病性无特定的相关性［28］。

3 小结

青枯菌这个复杂种至少包含有4个遗传群体或种系型，反映出其遗传多样性和地理起源信息。人们通过各种方法把青枯菌分型是为了作物育种工作者、植物病理学者和植物保护人员能更好地了解青枯菌的寄主、分布、遗传及致病力等信息，减少或控制农作物的经济损失。随着收集的青枯菌资源不断丰富，可能会有越来越多的青枯菌株系划分到各个种系型中，序列型数目会越来越丰富。收集和分类青枯菌资源非常重要，但更重要的是了解青枯菌株系的生态、进化、遗传及致病力等特性，这些信息对于控制青枯病危害的研究尤其重要。近年来，已经报道完成了青枯菌多个株系的全基因组的测序［29-34］，这些青枯菌全基因组测序信息的解析和积累，青枯菌致病基因家族信息分析及青枯菌致病途径的阐述，将有助于青枯菌种内分型的推进，及青枯菌与宿主相互作用的研究和青枯病的防控研究。

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