家庭冰箱中的微生物种类调查

羊宋贞 冯广达 姚青 王永红 姚雨欣 朱红惠

随着生活水平的提高，冰箱已成为家庭生活中必不可少的电器之一，在保鲜和预防食物变质等方面起到了重要作用。冰箱中的食物也常被认为是“最干净”的，在广州市先烈中路小学学生中的调查发现：65％的学生认为冰箱是家庭中最为干净的场所，他们有着直接食用冰箱中的水果、饮料等食物的习惯。而事实上，冰箱低温的环境仅能降低部分微生物的生长速度，并不能创造无菌的环境。储存于冰箱中的食物会随时间的推移而变质［1］。人们也常因食用冰箱里的食物而感染病菌。家庭冰箱中的微生物主要由哪些种类构成，以及是否存在致病菌等问题目前未见报道。针对该问题，本研究随机选取了5个单位同事的家庭冰箱进行了微生物的分离培养，通过PCR和DNA测序对其种类进行了初步鉴定，以期了解家庭冰箱中的微生物，为冰箱的科学合理使用提供建议。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂及仪器 牛肉膏（广东环凯微生物科技有限公司）、蛋白胨（英国Oxoid公司）、Easy-TaqTMDNA聚合酶（北京全式金生物技术有限公司）、dNTP（广州东盛生物科技有限公司）、琼脂糖（美国Amresco公司）；PCR仪（德国耶拿公司）、电泳仪（北京市六一仪器厂）、高速离心机（美国Sigma公司）。

1.1.2 材料 随机选取了Li、Lu、Wang、Yang和Zhu等5个同事的家庭冰箱为研究对象，对每个家庭冰箱中不同位置的微生物取样调查。

1.1.3 培养基 营养琼脂培养基成分：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂 15g，H2O 1L；马铃薯葡萄糖琼脂培养基成分：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，H2O 1L；高氏1号培养基成分：可溶性淀 粉 20g，KNO31g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g，NaCl0.5g，FeSO4·7H2O0.01g， 琼 脂 15g，H2O 1L。

1.2 方法

1.2.1 分离方法 采用灭菌棉签擦拭冰箱的冷藏室和冰箱门内壁，后放入灭菌试管中，带回实验室分析。此外，将预先配制好的营养琼脂（NA）、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）和高氏1号培养基平板放入冰箱冷藏室中的不同位置，打开盖子，过夜放置，收集冰箱中悬浮的微生物，后30℃倒置培养7d。擦拭冰箱内壁的棉签采用无菌水洗涤，以10倍梯度逐级稀释，分别取100μL不同稀释梯度的菌液涂布于营养琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂和高氏1号培养基平板上，30℃倒置培养7d。随机挑取培养基上不同形态的菌株进行纯化，制备菌株的甘油种，保存于-80℃冰箱。

1.2.2 微生物鉴定 细菌菌株采用16S rRNA基因PCR扩增测序，引物为27F和1492R［2］。DNA提取采用煮沸法［3］，取2mL菌液于离心管中，12000r/min离心，弃上清，收集菌体，后加入无菌双蒸水200μL，涡旋均匀。95℃水浴5min，12000r/min离心1min，以2μL上清液作为模板。对于少数PCR扩增失败的菌株，则弃去煮沸的上清液，采用CTAB法［4］进行DNA提取。真菌DNA亦采用CTAB法提取。酵母菌采用26S rRNA基因PCR扩增测序，引物为NL1和NL4［5］，霉菌则采用ITS测序，引物为ITS1和ITS4［5］（表 1）。25μL PCR 扩增体系包括：1×Buffer，dNTP 200μmol/L，引物各0.2μmol/L，EasyTaq酶 1.25 U。细菌的PCR扩增程序为：95℃ 3min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1.5min，30 个循环 ；72℃ 20min，目的片段约为1.5 kb。真菌的PCR扩增程序：95℃3min ；94℃ 30s，53℃（26S rRNA）或 55℃（ITS）30s，72℃ 40s，30 个循环 ；72℃ 20min。26S rRNA基因和ITS目的片段分别约为680bp和700bp。PCR产物采用加入Gold View的1％琼脂糖凝胶电泳检验，由英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。将获得的所有菌株的测序结果在http：//www.ncbi.nlm.nih.Gov/网站进行BLAST，获得与之同源性最高的已知菌株。冰箱中分布广泛的真菌还采用扫描电镜观察其形态，方法参见文献［6］。

表1 用于细菌和真菌鉴定的通用引物

2 结果

2.1 家庭冰箱中的细菌分布情况

从5个家庭冰箱中分离到细菌84株，16S rRNA基因序列分析发现，它们涵盖了28个属，22个科，10个目，6个纲，4个门。在属水平上的分布情况如表2所示，家庭冰箱中的细菌主要以芽孢杆菌（Bacillus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、库克氏菌（Kocuria）和假单胞菌（Pseudomonas）4个属的菌株为主，分别占分离总菌数的16.67％、13.10％、11.90％和7.14％。其次为类芽孢杆菌（Paenibacillus）、微杆菌（Microbacterium）、短波单胞菌（Brevundimonas）、短杆菌（Brevibacterium）、短状杆菌（Brachybacterium）和玫瑰单胞菌（Roseomonas）等6个属，均分别占分离总菌数的3.57％。其他属的菌株均不足2％，包括了Acinetobacter、Carnobacterium、Cellulosimicrobium、Chruseobacterium、Curtobacterium、Enterococcus、Exiguobacterium、Janibacter、Leucobacter、Lysinibacillus、Massilia、Nocardiopsis、Oceanobacillus、Rahnella、Streptomyces、Arthrobacter、Micrococcus、Stenotrophomonas等18个属。

5个家庭冰箱中有4个均分离到了Bacillus属的菌株，主要为解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefacien）、蜡样芽孢杆菌（B.cereus）、巨大芽孢杆菌（B.megaterium）和产硫芽孢杆菌（B.thioparans）。Staphylococcus属的菌株在4个家庭冰箱中也均有分布，主要以溶血性葡萄球菌（S.haemolyticus）和人葡萄球菌（S.hominis）为主。Kocuria属的菌株也分布在4个家庭冰箱中，以沼泽考克氏菌（K.palustris）和嗜根考克氏菌（K.rhizophila）为主。Pseudomonas属的菌株在3个家庭冰箱中得到分离，主要以稻皮假单胞菌（P.oryzihabitans）为主。其余24个属的菌株仅零星分布于1-2个家庭冰箱中。家庭冰箱中的细菌在门水平上的分布情况如图1所示，主要以硬壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）为主，分别占分离总菌数的41.67％和36.90％。其次为变形菌门（Proteobacteria），占 20.23％（α-protebacteria、β-protebacteria和γ-protebacteria 3个纲分别占7.14％、1.19％和11.9％）。拟杆菌门（Bacteroidetes）仅占分离总菌数的1.19％。

表2 家庭冰箱中分离的细菌数量

图1 家庭冰箱中的细菌在门水平上的分布

84株细菌中有14株为致病菌，占16.67％。它们主要以Staphylococcus属的菌株为主，除溶血性葡萄球菌（S.haemolyticus）和人葡萄球菌（S.hominis）外，还包括了阿尔莱特葡萄球菌（S.arlettae）、山羊葡萄球菌（S.caprae）、上皮葡萄球菌（S.epidermidis）、科氏葡萄球菌（S.cohnii）、松鼠葡萄球菌（S.sciuri）、鸡葡萄球菌（S.gallinarum）和腐生葡萄球菌（S.saprophyticus），广泛分布于4个家庭的冰箱中。此外，冰箱中的致病菌还包括了藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、水生拉恩氏菌（Rahnella aquatilis）和鹑鸡肠球菌（Enterococcus gallinarum）。这些菌株均为致病菌或条件致病菌，感染对象为人或动物，表明家庭冰箱中存在着致病风险。

2.2 家庭冰箱中的真菌分布情况

表3 家庭冰箱中分离的真菌数量

图2 家庭冰箱中部分真菌的扫描电镜图

从5个家庭冰箱中分离到真菌74株，26S rRNA基因或ITS序列分析发现，它们涵盖了23个属，17个科，16个目，11个纲，3个门。在属水平上的分布情况如表3所示，家庭冰箱中的真菌主要以枝孢菌（Cladosporium）、曲霉（Aspergillus）和青霉（Penicillium）3个属的霉菌为主，分别占真菌总数的31.08％、20.27％和12.16％，代表菌株的扫描电镜观察结果如图2所示。其余属的菌株所占比例均分别不足3％，包括了Aureobasidium、Candida、Chaetomium、Cochliobolus、Cryptococcus、Emericella、Eurotium、Eutypella、Fusarium、Hanseniaspora、Hortaea、Lacazia、Meyerozyma、Phlebia、Pichia、Pleurotus、Pseudozyma、Rhizomucor、Rhodotorula、Toxicocladosporium等20个属。Cladosporium属的菌株主要由球孢枝孢（C.sphaerospermum）或枝状枝孢（C.cladosporioides）组成，在5个家庭的家庭冰箱中均有分布。Aspergillus属的菌株主要以杂色曲霉（A.versicolor）和聚多曲霉（A.sydowii）为主，在5个家庭冰箱中也均有分布。Penicillium属以草酸青霉（P.oxalicum）为主，分布在4个家庭冰箱中。其他属的菌株仅零星分布于1-2个家庭冰箱中。家庭冰箱中的真菌在门水平上的分布如图3所示，主要以子囊菌门（Ascomycota）为主，约占分离总菌数的89.19％，其次是担子菌门（Basidiomycota），占总菌数的9.46％。未知菌门（Unknown）最少，仅占1.35％。

分离得到的74株真菌中有4株为致病菌，约占5.4％，包括了黑色毛壳菌（Chaetomium nigricolor）、威尼克何德霉（Hortaea werneckii）、Lacazia loboi和Pseudozyma aphidis。这些致病菌零星分布于3个家庭冰箱中。与细菌相比，真菌中的致病菌数量相对较少，分布较为随机。

图3 家庭冰箱中的真菌在门水平上的分布

3 讨论

冰箱作为家庭生活的必备电器之一，在我国具有很高的普及率。随着生活节奏的加快，人们越来越习惯于将大量的食物储存其中，他们认为冰箱中的食物是最“安全”的，也常直接生食储存其中的水果、蔬菜等食物。事实上，冰箱的低温环境并不能杀死由空气、食物或其他储藏物品带入到冰箱中的微生物，只能延缓部分微生物的生长速度，人们食用后依然会引发疾病。周宇光等［7］就从家庭冰箱存放的蔬菜等食物中分离到了34株产生不良气味的冷育细菌。家庭冰箱里的微生物主要由哪些种类组成？是否存在潜在的致病风险？了解这些问题有助于人们在日常生活中科学合理地使用冰箱和养成良好的饮食习惯。为此，本研究对随机选取的5个家用冰箱中的细菌和真菌进行了分离培养和鉴定。研究结果表明，家庭冰箱中的细菌以Bacillus、Staphylococcus、Kocuria和 Pseudomonas属的菌株为主，其他属的菌株零星分布于不同家庭冰箱中。祝白春等［8］、辛克铭等［9］的研究均发现饮食业冰箱中存在着严重的霉菌污染，但未对霉菌的种类进行详细的研究。本研究也取得了类似的结果，发现家庭冰箱中的真菌主要是以Cladosporium、Aspergillus和Penicillium属的霉菌为主，其他属的菌株仅零星分布于不同的冰箱中。通过本研究可以发现，家庭冰箱中生活着种类丰富的微生物，长期低温的环境并不像常人想象的那样能消灭微生物。

本研究从家庭冰箱中分离得到微生物158株，其中致病菌18株，约占11.39％。致病菌中有14株为细菌，构成了家庭冰箱中的主要致病菌。它们大部分为Staphylococcus属的菌株，在4个家庭冰箱中均得到分离，这些菌株对人或动物具有致病性，且大部分的宿主为人。真菌致病菌相对较少，且分布较为分散。家庭冰箱中的这些致病菌可能引起的疾病较为广泛，不仅仅局限于消化系统的疾病，而是能够引起呼吸系统、泌尿系统、血液系统、皮肤、肌肉等病变，如多种类型的皮癣、膀胱炎、败血症等。Dugleux等［10］对11个患败血症病人病因研究发现，致病原是储存在冰箱中的肠胃营养添加剂中出现了阴沟肠杆菌的污染。由此可见，家庭冰箱中存在较高的致病风险，对人体的潜在威胁不容小觑。家庭冰箱中储存的物品较为复杂，包括生鲜的瓜果蔬菜、鱼肉蛋奶等，这些食品的来源也极为复杂，涉及的场所有农田土壤、菜市场、家禽家畜养殖场、水产养殖场、屠宰场等，使得家庭冰箱中微生物的群落构成也极为复杂，从而增加了冰箱的致病风险。因此，人们在使用冰箱过程中应注意定期对其进行清洗和消毒，以保持清洁的环境，减少致病菌的数量［11］，目前市场上专门针对冰箱的消毒产品仍有待研发。

4 结论

本研究结果表明，家庭冰箱中生活着种类丰富的微生物。其中，细菌主要以芽孢杆菌（Bacillus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、库克氏菌（Kocuria）和假单胞菌（Pseudomonas）属的菌株为主，广泛分布于家庭冰箱中。真菌则以枝孢菌（Cladosporium）、曲霉（Aspergillus）和青霉（Penicillium）属的霉菌为主。家庭冰箱中的致病菌主要为葡萄球菌属（Staphylococcus）的菌株，包括了溶血性葡萄球菌（S.haemolyticus）、人葡萄球菌（S.hominis）、上皮葡萄球菌（S.epidermidis）等，这些菌株对人或动物具有致病性，家庭冰箱存在潜在的致病风险。因此，冰箱的安全问题应引起足够的重视，人们在食用冰箱储存的食物时应先认真清洗其表面，或用开水浸泡灭菌，尽量避免直接生食。此外，还应加强对冰箱的定期清洁和消毒，以保障饮食的安全。

［1］ 王跃河, 肖建军.微生物对冰箱冷藏食品的影响研究.家电科技 , 2006（9）：45-48.

［2］ Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, et al.16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study.Journal of Bacteriology, 1991,173（2）：697-703.

［3］ Güssow D, Clackson T.Direct clone characterization from plaques and colonies by the polymerase chain reaction.Nucleic Acids Research, 1989, 17（10）：4000.

［4］ Guo LD, Hyde KD, Liew ECY.Identification of endophytic fungi from Livistona chinensis based onmorphology and rDNA sequences.New Phytologist, 2000, 147（3）：617-630.

［5］ White TJ, Bruns T, Lee S, et al.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics.PCR protocols：a guide tomethods and applications［M］.New York：Academic Press, 1990：315-322.

［6］ 东秀珠, 蔡妙瑛.常见细菌系统鉴定手册［M］.北京：科学出版社, 2001：362-363.

［7］ 周宇光, 崔存起, 李钟庆.嗜冷微生物和冷育微生物的研究Ⅳ.冰箱中产生怪味的冷育微生物.微生物学通报, 1989（2）：79-82.

［8］ 祝白春, 王解盾, 邢晓慧.南京市餐饮冰箱微生物污染调查.江苏预防医学, 1997（1）：69-70.

［9］ 辛克铭, 朱荔芳.饮食业家用冰箱贮存熟肉制品的微生物变化 .食品科学, 1993（8）：55-57.

［10］ Dugleux G, Coutour XL, Hecquard C, et al.Septicemia caused by contaminated parenteral nutrition pouches：the refrigerator as an unusual cause.Journal of Parenteral ＆ Enteral Nutrition, 1991, 15（4）：474-475.

［11］ 于晓波, 姜梅, 韩峰.医院冰箱微生物监测与消毒方法.中华医院感染学杂志, 2008, 18（5）：733.