四翅滨藜Osmotin-like Protein基因的克隆、序列分析及其原核表达

王升阳 张勇 王健 刘言志 刘金亮 潘洪玉

植物抗病原物侵染反应与多种生理生化调节相关，其中包括细胞壁木质化、植物抗毒素的合成、病程相关蛋白（pathogenesis-related proteins，PRP）基因的表达，这些蛋白如几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶等。PRP根据序列相似性及免疫学相关性分为17个家族［1］，其中病程相关5（PR-5）蛋白是第5家族，具有β-1，3葡聚糖酶、抗真菌侵染、抗冻、抗渗透压力等多种生物学活性，参与植物系统获得抗性（SAR）和过敏反应（HR），在植物抵御生物和非生物胁迫中具有重要作用［2］。另外，PR-5蛋白与甜蛋白的氨基酸序列同源性高，也被称为类甜蛋白（thaumatin-like protein，TLP）。同时，由于 PR-5 蛋白独特的抗真菌活性，良好的稳定性，而且对人体无毒，使它成为一种潜在的绿色抑菌药剂。PR-5 蛋白包含了具有多种抗逆功能的渗调蛋白（osmotin）和类渗调蛋白（osmotin-like protein，OLP）。在植物体中，osmotin 是一种阳离子蛋白，OLP 与osmotin相比，pI偏低，并富含丝氨酸、苏氨酸，可能使它在植物中具有不同的生理生化功能［3］。Osmotin最初作为在高浓度NaCl环境中培养的烟草细胞中主要积累的一种蛋白而分离得到［4］；许多研究已经证明，OLP可被微生物侵染和多种非生物胁迫因素激活表达［5］。目前，尽管人们还不完全清楚OLP的生物功能，但是一些试验已经证明OLP可作为一种抗真菌的体外蛋白［6］。目前，国内外学者陆续从大洋洲滨藜（Atriplex nummularia）、番茄（Lycopersicon esculentum）、阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana）、野海茄（Solanum dulcamara）、辣椒（Capsicum annuum）等植物中克隆了osmotin-like protein基因。迄今为止，有关四翅滨藜osmotin-like protein基因的研究还鲜有报道。本试验从四翅滨藜的cDNA文库中筛选出AcOLP基因，并对其进行序列分析和原核表达的相关研究。

1 材料与方法

1.1 材料

四翅滨藜cDNA文库大肠杆菌菌株DH10B由本实验室构建并保存；大肠杆菌E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）菌株与表达载体pET-28a由本实验室提供；克隆载体pMD18-T Vector购自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 文库目标克隆子的获得 随机挑选文库克隆，提取质粒DNA，以载体pYES-DEST52上游（T7）：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'和下游（R）：5'-AGGGTTAGGGATAGGCTTACCTTC-3'为测序引物，进行全序列测定得到EST序列，然后在NCBI BLASTX库进行比对。

1.2.2 AcOLP基因的克隆及测序 根据目的基因序列，设计合成一对PCR扩增特异性引物。上游引物：5'-CGGGATCCATGAATTCCTCCTTGATGAAAT C-3'，下划线为BamHⅠ酶切位点；下游引物：5'-CCCTCGAGTCAAGGACAAAATGTAACTAC-3'，下划线为Xho Ⅰ酶切位点。以四翅滨藜cDNA为模板进行 PCR，反应体系（25.0μL）为 ：ddH2O 18.0μL、10×Pfu PCR Buffer（含 Mg2+）2.5μL、Forward Primer 1.0μL、Reverse Primer 1.0μL、dNTPs 1.0μL、Template 1.0μL、Pfu 酶0.5μL。反应程序为 ：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30 s、72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物经过电泳检测鉴定正确后，进行回收，将回收的AcOLP基因片段进行加“A”反应后与pMD18-T Vector连接，连接反应按照试剂盒说明书进行，16℃条件下连接1h，构建重组质粒pMD18T-AcOLP。连接产物用CaCl2化学转化法转化E.coli DH5α感受态，LB（Amp+）平板上37℃培养箱培养过夜。挑取平板上的单菌落，接种于LB（Amp+）液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养过夜。采用碱裂解法小量提取质粒，经BamHⅠ和Xho Ⅰ双酶切验证、PCR鉴定，将获得的3个阳性重组质粒送至Invitrogen公司测序。根据测序结果进行序列比较和分析。

1.2.3 AcOLP基因的原核表达 用BamHⅠ和XhoⅠ对重组质粒pMD18T-AcOLP、表达载体pET-28a分别进行双酶切，电泳检测，回收，以T4 DNA连接酶于16℃过夜连接，连接产物转化到感受态细胞E.coli DH5α中，将转化产物涂布于50mg/L卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜。按照上述方法对平板上挑取的菌落进行酶切验证和PCR鉴定。将获得的原核融合表达重组质粒pET28a-AcOLP转化BL21（DE3）受体菌株中。PCR和酶切验证正确后，挑取其阳性克隆接种于3mL含卡那霉素的液体LB培养基中，37℃，200r/min振荡培养过夜，以1∶100的比例扩大培养，当OD600至0.4-0.6时，加IPTG至终浓度为1mmol/L，分别诱导0、2、4、6和8h。离心收集菌体，加入1/10体积的2×SDS上样缓冲液，煮沸10min，进行SDS-PAGE电泳。

2 结果

2.1 四翅滨藜osmotin-like protein基因的克隆

以四翅滨藜cDNA为模板，用所设计的特异性引物进行PCR扩增，对其产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，大约在700bp出现明显特异性条带（图1）

图1 PCR扩增产物电泳图

2.2 序列测定与分析

2.2.1 结构域和保守性分析 选取质粒PCR鉴定表现出阳性克隆及酶切鉴定可以切出目的片段的菌株进行测序。测序结果表明，AcOLP基因包含有全长为687bp开放阅读框，编码的多肽链含有229个氨基酸。将得到的序列提交GenBank，序列号为JN632587.1。以ExPASy网站的Compute pI/Mw tool计算可得AcOLP的等电点为6.04，分子量为24.07kD。在NCBI网站上对AcOLP基因编码的氨基酸序列进行保守区域分析。分析结果表明，该基因编码的蛋白质共有229个氨基酸残基，属于GH64-TLP-SF超家族，是一种病程相关5（PR-5）蛋白。推导的AcOLP氨基酸全长序列与其他植物中相关的PR-5蛋白序列的比对结果，如图2所示。AcOLP含有17个Cys残基，其中16个在PR-5蛋白中是高度保守的，可能与二硫键的形成有关［7］；在N端1-28氨基酸为预测的信号肽序列，可能与osmotin-like protein在内质网中的跨膜转运有关，信号肽的最后一个氨基酸为Ala，这在osmotin-like protein也是较为保守的［8］。

图2 六种PR-5蛋白氨基酸序列比对图

2.2.2 序列同源性分析 AcOLP与其他物种的相关序列有较高的同源性。核酸序列同源性分析表明，AcOLP基因与大洋洲滨藜osmotin-like protein基因（M84468.1）同源性最高，为94％；与其它植物如大米草（Spartina anglica）、西藏南美藜（Chenopodium quinoa）的osmotin-like protein基因的同源性也在81％以上。AcOLP基因编码的蛋白序列与大洋洲滨藜osmotin-like protein蛋白（AAA32909.1）序列同源性达87％，与上述其他植物中的PR-5蛋白序列同源性基本都在50％以上。表明osmotin-like protein合成过程在植物进化中属于较保守进化。

2.2.3 系统发育关系分析 利用MEGA5.05软件对四翅滨藜、大洋洲滨藜、燕麦（Avena sativa）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、西藏南美藜等的PR-5蛋白序列进行比对并构建系统发育树状图（图3），可以看出，比对的PR-5蛋白被分成了两大类，四翅滨藜与大洋洲滨藜的亲缘关系最近，四翅滨藜、大洋洲滨藜、西藏南美藜比对的PR-5蛋白属于类渗调蛋白（osmotin-like protein，OLP）。

图3 四翅滨藜与部分物种PR-5蛋白氨基酸推导序列系统进化树

2.3 AcOLP基因原核表达

将鉴定为阳性的pET28a-AcOLP BL21（DE3）菌体经过终浓度为1mmol/L的IPTG分别诱导0、2、4、6和8h。将诱导表达的蛋白经SDS-PAGE电泳检测，结果（图4）表明在29kD处出现一条特异性蛋白带，与预期大小一致，说明AcOLP基因编码的蛋白在大肠杆菌中得到了正确的表达。并且随着诱导时间的增加，目的蛋白的表达量逐渐增加，到4h达最大值。

图4 AcOLP在大肠杆菌BL21（DE3）中表达的SDSPAGE电泳图

3 讨论

我们从四翅滨藜cDNA文库中克隆了AcOLP基因，测序结果和同源性分析表明该基因编码蛋白属于PR-5家族蛋白，同时将获得的AcOLP基因连接到原核表达载体上诱导其原核表达。有关研究表明，osmotin-like protein能抵抗致病疫霉（Phytophthora infestans）的侵染，致病疫霉可引起马铃薯和番茄的晚疫病，但是目前还不清楚其高度保守的Cys是否与抗真菌作用有关。Osmotin-like protein可被多种非生物因素和生物因素所诱导，例如，ABA、SA、高浓度盐溶液、机械损伤、低温、真菌侵染，说明这种蛋白在渗透胁迫和抵御病原体侵染方面的双重功能［9］。金属阳离子影响PR-5蛋白与真菌细胞壁受体的作用。一种来源于烟草的PR-5蛋白osmotin，对其与酵母抑制作用进行研究，发现酵母细胞壁上聚甘露糖上的一个磷酸化位点是osmotin的受体［10］，而且其结构中的酸性凹槽是osmotin作用位点，此外这2个位点都是带负电荷。K+通过与磷酸基团结合影响osmotin与它的结合，从而抑制osmotin 在菌体细胞壁上的识别；此外，Ca2+会与K+竞争结合受体，能促进osmotin与磷酸基团的互相结合，因而增强 osmotin对菌体的毒性［11］。Osmotin-like protein较osmotin pI值偏低，因而可能具有更强的抗菌作用。而这一研究被运用在草莓贮运过程中，草莓被含Ca2+的溶液处理后，草莓在贮运中的腐败减少［12］，而且从草莓中发现的2个PR-5蛋白FaOLP［13］和FaOLP2［14］也验证了这一点。因此，本研究结果为osmotin-like protein的体外活性测试和通过植物基因工程提高植物的抗病性研究提供基础。

4 结论

本研究从四翅滨藜cDNA文库中扩增并克隆了AcOLP基因，测序结果和同源性分析表明，osmotinlike protein基因在高等植物的PR-5蛋白基因间保守性较高，四翅滨藜和大洋洲滨藜的osmotin-like protein的N-信号肽序列完全一致。AcOLP中含有16个保守的Cys，与二硫键的形成有密切的关系，有利于AcOLP结构的稳定。将AcOLP基因与原核表达载体pET-28a连接，进行融合表达，在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达出分子质量约29kD的蛋白。

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