Pseudomonas sp.101甲酸脱氢酶基因的合成、表达及定点饱和突变

李天明 朱灵桓 刘天佳 戴宝新 冯惠勇

氧化还原酶是催化制备羟基酸、手性醇、氨基酸等的一类重要的酶类。而在氧化还原酶所催化的反应中，约80％的反应需要尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，NADH）作为辅酶，一定量的辅酶会随着合成产物的生成而消耗，因此氧化还原酶在应用中特别需要高效、低成本的辅酶再生系统［1］。

甲酸脱氢酶（Formate Dehydrogenase，FDH，EC1.2.1.2）是氧化还原酶辅酶NAD+和NADH再生循环体系中的关键酶，它可以将甲酸氧化为CO2，同时将NAD+还原为NADH［2］。甲酸/甲酸脱氢酶作为NADH再生系统，其优势在于反应不可逆，甲酸价格低廉且很多酶对此有很高的耐受性；此反应只产生一种副产物CO2，对任何酶的活性均没有任何影响，而且很容易从反应体系中释放出来，有利于产物的分离、纯化［3］。在需要辅酶NADH再生的反应中，甲酸脱氢酶具有重要的应用价值和产业化应用前景。德国Degussa公司利用博伊丁假丝酵母（Candida boidinii）FDH再生NADH生产ter-L-亮氨酸，是成功利用酶法生产医药产品的典型例子之一［4］。

人工合成DNA是合成生物学研究的基础，利用重叠延伸PCR（gene splicing by overlap extension，SOE PCR）技术合成所需要的目的基因序列，在多个领域广泛应用［5］。本研究采用利用重叠延伸PCR，根据Pseudomonas sp.101来源的甲酸脱氢酶氨基酸序列［6］，成功合成了具有大肠杆菌碱基偏好性的FDH编码基因，并在E.coli BL21（DE3）中得到高效表达；为提高FDH的稳定性，采用融合PCR方法对FDH基因进行了饱和定点突变，旨在为FDH的广泛应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒 试验中需用的大肠杆菌E.coli DH5α，E.coli BL21（DE3）和pET-30a均为实验室保藏。

1.1.2 主要试剂 重叠PCR DNA聚合酶Phusion High-Fidelity DNA Polymerase购自NEB公司，限制性内切酶、TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、DNA分子量标准、蛋白质分子量标准购自大连宝生物工程公司（TaKaRa）；pEASY-T1克隆载体购自北京全式金生物技术有限公司；DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司；PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成；其他试剂均为分析级产品，购自生工生物（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因操作及蛋白质操作 LB培养基、分子克隆、表达产物SDS-PAGE分析参照文献［7，8］进行。DNA回收、质粒提取等根据试剂盒提供方法进行。

1.2.2 甲酸脱氢酶基因的合成

1.2.2.1 FDH的基因设计 按照Pseudomonas sp.101来源的甲酸脱氢酶氨基酸序列，选用大肠杆菌中高表达基因常用密码子编码，利用DNAWORKS在线软件设计，将全长1203bp的fdh基因分为48个片段，每个片段长46个碱基，相邻片段重叠部分为21bp，其中第一个和最后一个引物分别带酶切位点BamH I和Hind III［9］。

1.2.2.2 fdh基因的合成 将1.2.2.1设计各引物等比例混和，引物之间互相搭桥、互为模板进行PCR，PCR反应条件：98℃预变性30s；98℃变性10s，63℃退火30s，72℃延伸23s，循环30次；72℃延伸10min。将上述PCR的弥散产物作为模板，由两端引物再次进行PCR。PCR反应条件：98℃预变性30s；98℃变性 10s，60℃退火 30s，72℃延伸 30s，循环30次；72℃延伸10min。

1.2.2.3 fdh基因的克隆 纯化第二次的PCR产物，与pEASY-T1连接，构建pEASY-fdh质粒，转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布含100μg/mL氨苄青霉素、IPTG和X-Gal的LB平板，37℃培养过夜。挑取白色菌落，提质粒，用BamH I和Hind III双酶切验证，阳性克隆进行DNA序列测定。

1.2.3 表达载体的构建及fdh基因的表达 将测序正确的pEASY-fdh质粒和pET-30a质粒分别用BamH I和Hind III进行双酶切，片段与载体连接，构建表达载体pET30a-fdh，转化感受态E.coli BL21（DE3），涂布含50μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃培养12h，得到含fdh基因的重组E.coli。

把重组E.coli接种于含50μg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃培养至OD=0.6左右，加入诱导剂IPTG，使其终浓度为1mmol/L，16℃摇床培养。从加诱导剂时开始计时，在0、2、4和6h时分别取样1mL，用于SDS-PAGE电泳检测［7］。

1.2.4 重组的甲酸脱氢酶分离纯化 将1.5mL的菌液离心后收集菌体，重悬于20mmol/L磷酸钠缓冲液（pH7.5）中，悬浮后的菌体用超声波破碎仪短时多次超声破碎（工作功率为200-300 W，工作6s，间歇6s，破碎20次以上）。超声破碎后的溶液低温高速离心机离心后，取上清粗提液经过用上述缓冲液平衡的亲和层析微型镍离子螯合柱，上柱结合后，用100mmol/L咪唑充分洗脱，收集目的蛋白，测定FDH的蛋白浓度（Bradford法）。

1.2.5 甲酸脱氢酶的酶活测定 测定FDH酶活可利用产物NADH在340nm有最大吸收峰，通过测定不同浓度的NADH在340nm处的OD值，绘制标准曲线。反应体系如下：在10mmol/L pH7.5的磷酸溶液（含0.1mol/L β-巯基乙醇），1.67mmol/L NAD+，167mmol/L 甲 酸 钠， 共 200μL， 加 入 100μL FDH酶液，利用酶标仪检测，30℃反应，每隔30 s检测NADH在340nm处的吸收光度，作图得出时间与吸光度增加量的斜率。配置不同浓度的NADH标准溶液（0-0.6mmol/L）在340nm处测定吸光值，绘制标准曲线。拟合回归方程y=4.2429x-0.0093，计算每分钟NADH的增加量。

FDH活力定义为在pH7.5，30℃条件下，每分钟生成 1μmol NADH所需的酶量为 1个单位（U）［10］。

1.2.6 甲酸脱氢酶基因定点饱和突变 根据fdh基因序列以及要突变的位点设计引物。第146氨基酸位点突变引物，上游引物 FDH146F：5'-CGCTGAGGTTACTTACNNKAACTCCATAT-3'；下游引物 FDH14-6R：5'-AACTGATATGGAGTTMNNGTAAGTAACCT-3'；PCR扩增各段小片段基因：146-1、146-2，获得片段后，用两端引物进行搭接。以搭接后的PCR产物为模板，再进行第354氨基酸位点突变，引物分别为：上游引物 FDH354F：5'-TCTTGGAGNNKTTCTTCGAGGGTC-3'；下游引物 FDH354R：5'-GACCCTCGAAGAAMNNCTCCAAGATT-3'，获得 354-1以及354-2片段，用两端引物进行搭接。两次搭接反应体系如下：146-1和146-2片段（或者354-1和354-2片段）各0.5μL，上下游引物（20μmol/L）各0.5μL，10×Buffer 2.5μL，dNTPs 4μL，TaKaRa Ex Taq 1μL。将 PCR 产物纯化、连接 pET-30a，转化 E.coli BL21（DE3）［11］。

利用LB培养基，37℃培养转化子，诱导表达FDH，菌液离心，溶菌酶磷酸缓冲液裂解细胞，获得粗酶液［12］，30℃保温10h，用96微孔板分别测定保温前后酶的酶活，酶活降低小的突变酶，为稳定性高的突变酶。

2 结果

2.1 fdh基因合成和表达载体构建

FDH基因合成、克隆及表达载体构建的技术路线如图1所示。

图1 fdh基因合成、克隆及表达载体构建技术路线图

2.1.1 fdh基因的合成和克隆 通过重叠PCR扩增得到弥散条带，见图2-A，以此产物为模板，加入两端引物，通过PCR扩增得到1200bp的条带，与预计fdh基因大小一致，见图2-B。纯化PCR 产物，采用TA互补将回收的片段直接克隆法连接到T载体pEASY-T1上。挑选阳性克隆，提质粒，用BamH I和Hind III对构建的pEASY-fdh进行酶切验证，从图2-C可以看出，fdh与T载体连接成功。

图2 fdh基因的合成和克隆

2.1.2 序列测定和分析 重组阳性质粒pEASY-fdh经测序结果表明，甲酸脱氢酶fdh的基因长1203bp，将基因序列用DNAclub软件翻译为氨基酸序列后，与DNAWORKS在线软件设计的序列比对同源性达100％，说明pEASY-fdh构建成功。

2.1.3 表达载体pET30a-fdh的构建和验证 构建了质粒pET30a-fdh，用BamH I和Hind III酶切分析，酶切结果如图3所示，质粒pET30a-fdh被切成两条带，分别为5400bp的pET-30a质粒和1200bp的fdh基因条带，与预期结果相符。

图3 重组质粒pET30a-fdh酶切验证

2.2 FDH蛋白诱导表达

在OD达到0.6时，加入终浓度1mmol/L的诱导剂IPTG，16℃培养，分别在2、4和6h时取样，收集菌体，破碎细胞后利用12％的SDS-PAGE对诱导后的菌液进行分析，其蛋白电泳结果（图4）显示，在45kD处发现目的条带，在诱导2-6h后，FDH蛋白均有表达，并且蛋白的表达量随着诱导时间的延长而有所增加。由此可分析到，pET30a-fdh诱导后表达的蛋白约为45kD，此分子量与在线软件ExPASy-Compute pI-Mw tool分析的分子量44.5kD大小相符，说明该蛋白诱导表达成功。

图4 IPTG诱导fdh基因表达

2.3 FDH的比酶活

将诱导后的菌液经镍柱纯化后，测定纯化后的酶液蛋白浓度，进行酶活检测，根据回归方程得出每分钟NADH的增加量，其获得结果如表1所示，计算得到重组酶FDH的比活力为8.7U/mg。

表1 FDH比活力的测定

2.4 甲酸脱氢酶基因的饱和定点突变

2.4.1 甲酸脱氢酶基因146、354位点突变 表达的FDH在使用中不稳定，极易失活，主要是因为由于空气中氧或基质中其他化学物质的作用，半胱氨酸的氧化使FDH 失去活性。根据α螺旋疏水化处理静电作用和多肽的优化可以提高蛋白稳定性的原理［13］，选择对Cys146和Cys354两个位点先后进行饱和突变，以获得高稳定性的突变酶。通过重叠延伸PCR，在1200bp左右获得条带，位置与目的片段位置一致，结果如图5所示，为获得有效的突变体文库提供充足的基因片段。

图5 重叠延伸PCR扩增电泳图

2.4.2 饱和突变体库筛选结果分析 构建了突变后的质粒pET30a-fdh，经诱导表达后，用96微孔板进行突变体筛选。共筛选了763个转化子，转化子中大部分的酶活保温前后变化较大，经过多轮复筛，只筛选出一个突变子酶活变化较小的突变酶（数据略），经测序是Cys146Ala和Cys354Ala双位点突变。2.4.3 突变子比酶活的研究 野生型菌株和Cys146AlaCys354Ala的突变型菌株，同时进行诱导表达，将诱导后的菌液经镍柱纯化后，测定酶活，经计算得出结果如表2所示，突变前后FDH的比活力相差无几，没有明显变化。

表2 突变前后FDH比活力的测定

2.4.4 突变子热稳定性的研究 将野生型菌株和Cys146AlaCys354Ala的突变型菌株，分别16℃诱导培养24h，制成粗酶，置于30℃水浴中保温，分别于0、2、4、6、8和10h取样，测定其酶活力，以保温前的酶活力为100％，结果如图6所示，酶活呈指数型下降，利用指数函数对其拟合，经推算野生酶的半衰期为5.4h，突变酶的半衰期为13.8h，突变后fdh基因的热稳定性远高于野生型。

图6 稳定性变化曲线

3 讨论

甲酸脱氢酶在辅酶再生中的应用已成为辅酶法再生领域的热点之一。甲酸/甲酸脱氢酶体系是最成功的再生系统，并且已经应用于工业生产中。其最大优势在于反应的不可逆性，原料甲酸价格低廉以及唯一副产物CO2不会残留在体系中。人工合成基因已经是分子生物学中的一种常规技术，并且成为修改和克隆基因的强力工具。目前，虽然经过十几年的不断实践和总结，重叠延伸PCR方法已日益成熟，并在许多领域发挥重要作用，但是作为一种尚未标准化反应条件的技术，重叠延伸PCR技术在应用过程中还有许多问题急需解决，例如，最适合的引物长度大小，最优连续延伸的循环数，还有对合成进程中最佳分步控制等。这些问题还需进一步系统研究，为该技术的应用提供更多理论支持［14］。

本研究按照Pseudomonas sp.101来源的甲酸脱氢酶氨基酸序列，采用重叠延伸PCR技术，设计引物，并且通过不断调整退火温度及延伸循环数，合成了具有大肠杆菌密码子偏好性的fdh基因，经测序核酸序列与设计的同源性达到100％，合成过程中没有出现错配等现象。同时构建了原核表达载体pET30a-fdh，获得了基因工程菌pET30a-fdh/BL21（DE3）。通过IPTG诱导后，经SDS-PAGE电泳分析可发现FDH蛋白得到表达，并且蛋白的表达量随着诱导时间的延长而有所增加。由于重组的FDH在蛋白质C端融合有6×His标签，并且它对FDH的酶活性没有影响，从而将诱导后的菌液经镍柱纯化后，测得FDH的酶比活力达到8.7U/mg，与Tishkov［6］报道的FDH的比活力9.5U/mg相近。由于空气中氧或基质中其他化学物质的作用，同时半胱氨酸的氧化也会使FDH 失去活性，因而表达的FDH在使用中不稳定，极易失活。根据α螺旋疏水化处理静电作用和多肽的优化可以提高蛋白稳定性的原理，选择对Cys146和Cys354两个位点进行饱和突变，筛选出突变体后诱导表达，测定发现突变前后酶活变化不明显，但突变后酶的热稳定性得到提高。

随着氧化还原酶在催化制备有机化学品等方面优势的凸显，FDH的改造及在辅酶再生方面的应用越来越受到研究者的关注。但是，目前FDH的稳定性、催化效率还有待进一步提高；还需建立高效的表达体系和优化催化反应体系，降低生产成本，拓展FDH的更广泛的应用［15］。

4 结论

利用重叠延伸PCR技术，按照Pseudomonas sp.101来源的甲酸脱氢酶氨基酸序列设计重叠引物，合成了具有大肠杆菌密码子偏好性的fdh基因，与DNAWORKS在线软件设计的基因序列100％同源。构建了原核表达载体pET30a-fdh，获得了基因工程菌 pET30a-fdh/BL21（DE3）， 在 595nm 下 OD 达 到0.6时，加入终浓度1mmol/L的IPTG诱导，实现了FDH的可溶性活性表达，酶的比活力达到8.7U/mg。由于FDH不稳定，极易失活，根据α螺旋疏水化处理静电作用和多肽的优化可以提高蛋白稳定性的原理，选择对Cys146和Cys354两个位点进行饱和突变；经筛选，获得的Cys146AlaCys354Ala突变酶与野生酶相比，比酶活没有变化，但突变酶的热稳定性提高了2.5倍。

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