DAPT对人胶质瘤细胞系SHG－44增殖的抑制作用及机制

倪伟民 房 艳 衣服新 邱建武 丛 明 王 冰

(辽宁医学院附属第一医院神经外科，辽宁 锦州 121000)

最新研究表明，引起肿瘤复发转移生长的细胞只占全部肿瘤细胞的很小部分，称之为肿瘤干细胞(TSC)。近年来国内外学者相继从脑胶质瘤组织和细胞株中成功分离出脑胶质瘤TSC〔1〕(BTSC)，其在胶质瘤的发生、发展及复发过程中均起着决定性作用。研究表明Notch信号通路〔2〕在正常干细胞和TSC的自我更新、增殖及分化过程中起主要的调控作用，该通路的关键蛋白在肿瘤细胞的增殖过程中表达异常。氮-〔氮-(3，5-二氟苯乙酰)-L-丙氨酰〕-S-苯基甘氨酸丁酯(DAPT)是一种人工合成的γ-分泌酶抑制剂，是目前公认为Notch信号通路的阻断剂。但DAPT在抗肿瘤方面的研究尚少，本文拟分析DAPT对SHG-44细胞增殖的抑制情况及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞系、试剂和仪器 人胶质瘤SHG-44细胞株购自中科院上海细胞库。L-DMEM培养基购自Hyclone公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，总RNA提取试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，RT-PCR一步法试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，DAPT购自瑞士ALEXIS公司，碘化丙啶(PI)、MTT购自美国Amersco公司。抗Notchl、抗Deltal、抗Hes1购自美国Chemicon公司;引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，凝胶成像系统为北京Tanon公司产品，PCR仪为美国MJ Research公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 常规复苏SHG-44细胞，L-DMEM培养液(10%FBS)、37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，每3 d换液，达90%融合时传代培养。

1.2.2 实验分组 将SHG-44细胞随机分5组，分别应用不同浓 度 的 DAPT，A 组:0 μmol/L;B 组:0.5 μmol/L;C 组:1.0 μmol/L;D 组:5.0 μmol/L;E 组:10.0 μmol/L。L-DMEM(10%FBS)，37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养，每3 d换液。

1.2.3 MTT法检测DAPT对SHG-44细胞增殖的影响 取传代培养的SHG-44细胞，0.25%胰酶消化，以1×104ml－1的细胞悬液接种于96孔板，培养24 h后，按上述5组的浓度加入DAPT，于5 d内的每 24 h取出一板，每孔加入 20 μl MTT(5 mg/ml)，37℃孵育 4 h，吸弃培养液，每孔加 DMSO 150 μl，振荡10 min，用酶联免疫仪选择570 nm波长测定各孔的光吸收值(OD值)，绘制各组细胞的增殖曲线。

1.2.4 流式细胞术检测细胞周期 收集上述5组不同浓度DAPT处理的SHG-44细胞48 h后，0.25%胰酶消化，计数细胞，调整细胞密度为1×106ml－1，4℃ 1 000 r/min离心5 min，细胞沉淀加入预冷的70%乙醇轻轻吹打悬浮，4℃固定过夜。次日固定后的细胞800 r/min离心5 min，加500 μl的PI染液(0.05‰ PI，0.02‰ Rnase)吹打悬浮，4℃避光静置染色30 min，上机检测。

1.2.5 流式细胞术检测CD133+的细胞比例 应用上述5组浓度DAPT处理SHG-44细胞48 h后，胰酶消化，计数细胞，调整细胞密度为1×106ml－1。4℃ 1 000 r/min离心5 min，将细胞重悬并移入 EP管(100 μl/管)，每管加入 FITC标记的CD133抗体10 μl，以不加抗体作为阴性对照，避光孵育30 min，PBS洗涤以去除未结合的抗体，4℃ 1 000 r/min离心5 min，加500 μl PBS，上机检测。

1.2.6 RT-PCR 检测 Notch-1，Delta-l，Hes-1 mRNA 的表达DAPT处理SHG-44细胞48 h后，收集各组细胞，每2×106个细胞加入1 ml Trizol，消化细胞提取总RNA，用核酸蛋白定量仪测定RNA浓度与纯度。应用Takara的RT-PCR试剂盒，逆转录反应按照说明书进行:52℃，30 min;99℃，5 min;5℃，5 min，合成cDNA，PCR扩增。PCR结束后将反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，然后用凝胶成像分析系统拍照，并利用图像分析软件Gene Tools分析结果。PCR扩增引物与退火温度见表1。

表1 引物序列

1.2.7 Western印迹法检测Notch-1，Delta-l，Hes-1蛋白的表达

DAPT处理SHG-44细胞48 h后，收集各组细胞，用RIPA细胞解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度，充分混合沉淀加上样缓冲液，SDS-PAGE变性凝胶电泳，转膜印迹，封闭，兔抗人Notch-1(1∶1 000)，Delta-l(1∶800)，Hes-1(1∶1 000)一抗孵育，4℃静置过夜，洗涤，结合HRP标记的二抗，洗涤，HRP-ECL发光。

2 结果

2.1 细胞的形态观察 经DAPT处理48 h后SHG-44细胞出现了明显的形态和数量变化:A组细胞数目多，梭形细胞为主，不规则细胞比例较低，细胞间黏附完好，密集排列于培养板底。B组细胞数目较A组稍有减少，形态变化不明显;C组经1.0 μmol/L DAPT处理的SHG-44细胞数目明显减少，不规则及大体积细胞比例增多，细胞稀疏分布于培养瓶底。D、E组细胞数目减少更加明显，可见细胞坏死崩解，残存细胞形态不规则，边缘不整，不易贴壁而悬浮于培养液中。见图1。

图1 各组SHG-44细胞的形态变化(相差显微镜，×100)

2.2 MTT检测结果 与A组比较，B、C、D、E组的SHG-44细胞增殖均受到DAPT的抑制，其中B组与A组比较具有明显差异(P＜0.05)，但B组增殖程度明显高于C、D、E组(P＜0.05)。表明随着DAPT浓度的增加，抑制作用增强，但C、D、E组无明显差异(P＞0.05)。表明DAPT可以明显抑制SHG-44细胞增殖，并具有DAPT浓度依赖性，而C组的抑制效果已比较显著，且与更高浓度组无显著差异，可以成为首选治疗浓度(图2)。

图2 各组SHG-44细胞的增殖曲线

2.3 DAPT对SHG-44细胞周期的影响 流式细胞术检测结果显示，与A组比较，B、C、D、E各组的SHG-44细胞经DAPT作用48 h后，G0/G1期细胞比例显著增加(P＜0.05)，S期细胞明显减少(P＜0.05)。B组各期细胞比例的变化明显低于C、D、E组(P＜0.05)，而C、D、E组之间无明显差异(P＞0.05)。表明DAPT可以使SHG-44细胞聚集于G1/G0期，降低S期细胞比例，C组即可达到明显的抑制作用(表2)。

表2 各组SHG-44细胞各期细胞的百分比(±s，n=20，%)

表2 各组SHG-44细胞各期细胞的百分比(±s，n=20，%)

与A组比较:1)P＜0.05;与B组比较:2)P＜0.05

分组 G0/G1 S G2/M A组56.25±1.31 28.47±1.24 15.38±0.87 B组 61.97±5.801) 23.89±4.421) 15.25±3.61 C组 67.19±4.721)2) 18.57±2.301)2) 14.05±1.53 D组 68.73±7.681) 18.45±2.201) 13.82±1.36 E组 70.58±9.441) 16.39±3.351)13.03±3.41

2.4 CD133+的TSC比例 流式细胞术检测结果显示，B、C、D、E组的SHG-44细胞经DAPT作用48 h后，CD133+细胞比例明显下降，表达量分别是 A组为(25.75±2.13)%，B组为(19.57±3.04)%，C组为(15.91±2.98)%，D组为(10.15±2.33)%，E 组为(7.02±3.17)%。与 A 组比较，B、C、D、E 组均明显下调了CD133+细胞比例(P＜0.05);而随药物浓度增加CD133+细胞比例下降越明显(F=66.12，P=0.002)。表明DAPT使SHG-44细胞中CD133+的TSC比例明显下降，具有明显剂量依赖性。

2.5 RT-PCR检测结果 Notch信号通路上游基因Notch-1、Delta-1和靶基因Hes-1表达水平的变化趋势基本一致。与A组比较，4组经DAPT处理的细胞这3种基因表达水平明显降低(P＜0.05)。而B组的表达水平明显高于 C、D、E组(P＜0.05)，但C、D、E组之间表达水平无明显差异(P＞0.05)。表明DAPT可以下调SHG-44细胞中Notch信号通路上游基因Notch-1、Delta-1和靶基因Hes-1的表达水平，C组效果与D、E高浓度组无明显差异，可以作为药物浓度的最佳选择(图3)。

图3 各组SHG-44细胞后的基因表达

2.6 Western印迹结果 与A组比较，B、C、D、E组的3种蛋白表达水平明显减弱(P＜0.05)。而B组的表达水平明显高于C、D、E 组(P＜0.05)，C、D、E 组之间表达水平无明显差异(P ＞0.05)。表明DAPT可以下调SHG-44细胞中Notch信号通路上游基因Notch-1、Delta-1和靶基因Hes-1的蛋白表达，C组下调效果与D、E高浓度组无明显差异(图4)。

图4 各组SHG-44细胞后的蛋白表达

3 讨论

胶质瘤是最常见的颅内恶性肿瘤，发病率、死亡率都很高，病程难以控制。其传统的化疗药物主要针对高度增殖的肿瘤细胞，最大限度地清除或杀灭肿瘤组织和细胞。TSC的存在是导致肿瘤的复发、转移及化学耐药等的根本问题。Notch信号通路在干细胞和TSC的增殖分化中起重要作用，并发现Notch信号通路在多种肿瘤中异常活化〔3〕。

Notch信号通路由Notch受体、Notch配体和CSL(一种DNA结合蛋白)三部分组成，配体与受体结合后，Notch受体相继发生两次蛋白水解。第二次是由γ-分泌酶(γ-secretase，又称早老蛋白presenilin，PS)在跨膜区靠近胞膜内的位点切割蛋白，使具有核定位信号的胞质内区域(NICD)释放入细胞质，进入细胞核与DNA结合蛋白CSL相互作用，导致下游的Hes、Hey、HERP、bHLH基因激活，影响细胞的增殖、分化和凋亡〔4〕。γ-分泌酶是Notch信号激活过程中的关键酶〔5〕。应用γ-分泌酶抑制剂可以阻断Notch信号通路中NICD的产生，从而抑制NICD引发的细胞分化、增殖和凋亡的异常。另外γ-分泌酶抑制剂还能干扰肿瘤细胞与脉管上皮细胞之间的Notch信号转导，从而抑制肿瘤中血管的生成。DAPT是一种人工合成的γ-分泌酶抑制剂，被公认为Notch信号通路的有效阻断剂，经证明在抗肿瘤方面具有潜在作用〔6〕。

本实验提示1.0 μmol/L DAPT可成为临床治疗的有效浓度。有研究〔7〕检测了6种人脑胶质瘤细胞系和原发性人脑胶质瘤中Notch-1及其配体Delta-1、Jagged-1 mRNA和蛋白的表达，结果三者均呈过度表达，另外，免疫组化染色显示绝大多数Ⅱ级和Ⅲ级胶质瘤中Notch-1蛋白有中到高水平表达。本实验结果提示肿瘤的恶性程度与Notch的活化相关。结合MTT和细胞周期检测结果，DAPT对胶质瘤细胞系SHG-44的增殖抑制作用有可能与Notch-1，Delta-1，Hes-1 mRNA的下调有关。Hes-1蛋白还能通过抑制Cyclin依赖性激酶抑制因子p27的转录而促进细胞增殖〔8〕，下调Hes-1的表达则起到抑制细胞增殖的作用。本研究还发现DAPT可使SHG-44细胞系中CD133+比例明显下降，降为原来的四分之一左右。Fan等〔9〕发现在体外培养的BTSC中，阻断Notch信号，CD133表达阳性细胞数量降为原来的五分之一。与本实验结果基本一致。CD133+被认为是BTSS的特征性标记，CD133+细胞表达比例下降提示SHG-44细胞系中TSC明显减少。抑制Notch通路可明显抑制TSC的增殖，其下降机制也可能与Notch-1，Delta-1，Hes-1 mRNA的下调有关。同时TSC的减少也是抑制肿瘤增殖的重要手段，可能为恶性肿瘤的根治提供帮助。

综上，DAPT可通过阻断Notch信号通路抑制SHG-44细胞的增殖，1.0 μmol/L的药物浓度即可达到明显的作用效果，DAPT细胞毒性低，副作用少;DAPT可以明显抑制TSC增殖。

1 Singh SK，Hawkins C，Clarke ID，et al.Identification of human brain tumour initiating cells〔J〕.Nature，2004;432:396-401.

2 Sjolund J，Manetopoulos C，Stockhausen MT.The Notch pathway in cancer:differentiation gone awry〔J〕.Eur J Cancer，2005;41(17):2620-9.

3 Maliekal TT，Bajaj J，Giri V，et al.The role of Notch signaling in human cervical cancer:implications for solid tumors〔J〕.Oncogene，2008;2738:5110-4.

4 Wang Z，Zhang Y，Li Y，et al.Down-regulation of Notch-1 contributes to cell growth inhibition and apoptosis in pancreatic cancer cells〔J〕.Mol Cancer Ther，2006;5(3):483-93.

5 Wang Z，Zhang Y，Banerjee S，et al.Inhibition of nuclear factor kappab activity by genistein is mediated via Notch-1 signaling pathway in pancreatic cancer cells〔J〕.Int J Cancer，2006;118(8):1930-6.

6 Grottkau BE，Chen XR，Friedrich CC，et al.DAPT enhances the apoptosis of human tongue carcinoma cells〔J〕.Int J Oral Sci，2009;1(2):81-9.

7 Purow BW，Haque RM，Noel MW，et al.Expression of Notch-1 and its ligands，Delta-Like-1 and Jagged-1 is critical for glioma cell survival and proliferation〔J〕.Cancer Res，2005;65(6):2353-63.

8 Wang Z，Zhang Y，Li Y，et al.Down-regulation of Notch-1 contributes to cell growth inhibition and apoptosis in pancreatic cancer cells〔J〕.Mol Cancer Ther，2006;5(3):483-93.

9 Fan X，Matsui W，Khaki L，el al.Notch pathway inhibition depletes stemlike cells anti blocks engraftment in embryonal brain tumors〔J〕.Cancer Res，2006;66(15):7445-52.