水生生物体内抗氧化酶及其影响因素研究进展

2013-09-12亢玉静郎明远

微生物学杂志 2013年3期

亢玉静，郎明远，赵文

(大连海洋大学水产与生命学院辽宁省水生生物学重点实验室，辽宁大连 116023)

生物体在正常的新陈代谢过程中，细胞内会产生少量的自由基，参与了机体内多种生理过程(如机体防卫、某些物质的合成等)，具有重要的生理功能。但是在病理或逆境下，体内产生的活性氧大量积累，打破了细胞内原有的动态平衡状态，将会对细胞产生损伤，必须及时将其清除。在长期的进化过程中，生物体内产生了一些物质能够清除体内的活性氧，其中起重要作用的是抗氧化酶类。

1 活性氧自由基的来源及其作用

所有的需氧生物在新陈代谢过程中，体内细胞都会产生一定的自由基(free radical)，即具有不成对电子的分子、原子、离子和基团。其化学性质极为活泼，易于失去电子(氧化)或获得电子(还原)，特别是氧化作用强，故具有强烈的引发脂质过氧化的作用。在体外，产生自由基的方式有很多种，比如加热、紫外光照射、电磁辐射、氧化还原反应等，一旦生物体内生成过多的自由基，而机体本身对自由基的防御能力不足时，就可引起生理变化。自由基包括超氧阴离子自由基、羟自由基、脂氧自由基、一氧化氮自由基等，活性氧自由基对生物机体可产生一系列的损伤，例如攻击多聚不饱和脂肪酸，引起细胞膜发生脂质过氧化，从而改变生物膜结构和功能;通过破坏蛋白质的巯基和氨基的结构，可引起蛋白质变性、交联，丧失酶的活性，而损伤DNA还可导致基因突变。因此，生物体内活性氧的生成与清除的平衡对生物体新陈代谢是相当重要的。

2 生物体对自由基的防御—抗氧化酶系

为了防止自由基对生物体的损害作用，在需氧生物体内进化了一种有效的防御机制［1］，一是酶促反应，即具有特异性的抗氧化酶系统，如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等;另一种是非酶促反应，主要是一些具有抗氧化作用的抗氧化剂，包括维生素E、维生素C、谷胱甘肽、类胡萝卜素、胆红素等。

抗氧化酶系［2］主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和谷胱甘肽硫转移酶(GST)等。超氧化物歧化酶(SOD)［3］是广泛存在于动物、植物和微生物中的具有核基因编码的一类含有金属元素的氧化还原酶类。SOD是目前发现的唯一以超氧阴离子自由基(O2－)为底物的酶，可催化O2－转化为H2O2和O2，从而清除O2－，在维持生物机体内的自由基产生与消除的动态平衡中起着极其重要的作用。SOD按其分子所含金属辅基的不同可以分为3类:Cu，Zn-SOD分布于哺乳动物红细胞和胞液中;Mn-SOD存在于线粒体中;Fe-SOD主要见于细菌中。作为免除自由基损伤的重要抗氧化酶，SOD在生物的新陈代谢中起着不可忽视的作用，如神经存活［4］以及信号传递［5］等，除此之外，超氧化物歧化酶的活性还与生物的免疫水平密切相关，对于增强吞噬细胞的防御能力和整个机体的免疫功能有重要作用［6］。生物体内生成的SOD不是恒定不变的，受环境影响，当细胞内ROS增加时，诱导SOD合成，避免由于氧代谢产生的过多自由基引起的氧化损伤。

过氧化氢酶(CAT)［7］是一类广泛存在于动植物和微生物体内的末端氧化酶，其功能是催化细胞内过氧化氢分解成水和氧分子，使得H2O2不至于与O2－铁螯合物作用下反应生成非常有害的－OH，防止膜脂过氧化。CAT活性的变化在一定程度上能反应出机体在胁迫环境下的免疫力［8］，因此可以测定CAT的活性变化来检测环境胁迫对生物的影响。

谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是生物体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。硒是GSH-Px酶系的重要组成成分，它可以催化GSH反应生成GSSG的同时，促进了H2O2的分解，将有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，进而保护细胞膜的结构及功能损伤，是反应机体抗氧化能力的重要指标之一。GPX在过氧化氢酶含量很少或是机体产生H2O2很低的组织中还可以替代CAT清除H2O2［9］，不仅能够清除脂类氢过氧化物，还可广泛的清除有机氢过氧化物［10］，具有防止畸变、预防衰老等重要生理作用。GPX活性的变化可以间接反应生物体在环境的改变下体内的抗氧化状态，能够作为机体受到胁迫的生物标志物。

3 脂质过氧化物—丙二醛(MDA)

机体通过酶系统与非酶系统产生的氧自由基，能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸(PUFA)，引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物。如:醛基(丙二醛MDA)、酮基、羟基、氢过氧基以及新的氧自由基等。脂质过氧化作用不仅把活性氧转化成活性化学剂，即非自由基性的脂类分解物，而且还通过链式反应将活性氧的作用放大。因此，初始的一个活性氧能导致很多脂质过氧化物的生成，其中一些是无害的，另一些则能够引起细胞代谢功能减弱，甚至导致生物体死亡。MDA作为不饱和脂肪酸过氧化终产物之一，能与蛋白质的－SH和－NH2作用，既可以产生蛋白质分子内交联也可产生分子间交联，是依赖－SH或－NH2维持活性的酶失活，使激素受体损伤，因此被当作是一种细胞膜氧化损伤的指示物［11］。测试MDA的量常常可以反映机体内脂质过氧化的程度，间接的反映出细胞损伤的程度。

MDA的测定常常与SOD的测定相互配合，SOD活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力，正常生理状态下，机体内MDA的含量是极低的［12］，其含量的高低又间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度，通过SOD与MDA的结果分析有助于医学、生物学、药理及工农业生产的发展。

4 抗氧化酶之间的作用

SOD、CAT 和 GSH-Px之间具有协同作用［13］(图1)，生理条件下组织和细胞中存在一定ROS，SOD中的Cu2+可被H2O2还原从而失去活性，CAT 和GSH-Px可消除H2O2，对SOD有一定的保护作用;O2－也可以使 CAT和 GSH-Px失活，而SOD又能够保护这2种酶，因此这3种酶组成了生物体内相互保护的防御系统。SOD、CAT和GSH-Px一起可以减轻并阻止脂质过氧化的一级触发作用，还可通过还原氢过氧化物来减轻阻止二级触发反应，三者组成机体防御自由基的体系是互为补充，相辅相成［14］，3种酶的联合效应，能够更有效的清除生物体内的活性氧自由基，保护机体不受损害。

图1 SOD、CAT和GSH-Px在细胞中的分布及相互作用示意图［13］Fig.1 The distribution and interaction of SOD、CAT and GSH-Px［13］

5 环境因素对水生生物体内抗氧化酶活性的影响

5.1 温度

温度是影响水生生物存活最重要的环境因子之一，不仅对其生长和繁殖起决定性的作用，而且对生物机体的代谢有较为明显的影响。温度是生物体内酶活变化的函数，即在一定温度范围内，随着温度的升高，酶催化反应的速度加快并在某一温度下，酶活力达到最大值;超过一定的反应温度，酶催化反应速度反而随着温度的升高而减慢。温度的急剧变化能直接影响水生生物体内抗氧化系统［15］，主要是因为温度改变，能够导致机体耗氧量增加［11］，从而促进ROS的产生以及细胞的氧化状态，引起相关抗氧化剂和氧化酶体系的一系列反应［16-17］。宋林生等［18］研究了中华绒螯蟹在温度骤升9 h后抗氧化酶活力的变化，结果发现，肝胰腺中CAT和SOD活性在温度升高后马上出现显著降低，在6 h后开始趋于稳定;MDA的含量在升温后随时间的延长逐步增加。Chen等［19］研究表明，在温度突变后，栉孔扇贝的血细胞数、细胞内的ROS、ACP和SOD等免疫指标均发生显著变化。李大鹏等［20］发现水温对中华鲟体内自由基水平及其抗氧化防御体系有着显著的影响。研究发现，在细菌［21］、原生动物及枝角类［22］等微型生物中，其体内抗氧化酶活性在低温胁迫或是高温胁迫下，都有显著提高，以此来抵御活性氧对机体的损伤。由此说明，温度的骤然改变会影响机体的生理功能和免疫防御能力，会导致自由基代谢的紊乱，从而影响机体的新陈代谢。

5.2 盐度

作为重要的环境因子之一，盐度能够直接影响水生生物的存活生长、渗透调节以及免疫能力。盐度的变化能够对水生生物造成一定的渗透胁迫，引起应激反应［23］。在等渗环境下，机体不需要耗能来进行渗透压调节，生物体表现出良好的生长状态，而在盐度变化后，机体处于非等渗环境，需要耗费大量能量来进行体内水盐代谢调节，一旦盐度超过了生物体自我调节范围，就会影响到其正常的生理代谢水平，从而导致疾病的爆发。国内外学者的研究集中于盐度对水生生物生长、存活、能量收支以及免疫生理变化的影响［24-30］。叶建生等［31］通过凡纳滨对虾在盐度突变后体内非特异性免疫因子的变化发现，盐度突变后，体内血细胞内O2－产量呈先升后降的趋势，酚氧化酶(PO)活力显著升高而SOD活性显著低于对照组。余燕等［32］探讨了点带石斑鱼幼鱼消化酶及抗应激酶在低盐度胁迫下的变化规律，结果表明SOD活力随盐度梯度下降呈上升趋势，CAT和GSH-Px活力以及消化酶活力随盐度梯度下降呈降低趋势，认为低盐度胁迫能导致鱼体自由基代谢紊乱，应激性增强，最终阻碍了幼鱼健康生长。通过盐度胁迫对盐生隐杆藻抗氧化系统的研究发现，随着盐度胁迫程度的增加，MDA含量和抗氧化酶(SOD、GR、APX、ASA、GSH)活性不断增强［33］。包斯琴等［34］在研究外生菌根菌 Paxillus的抗盐机理时发现，不同的菌株随盐度胁迫时间的变化，其体内抗氧化酶活性的变化规律有所差异，但是盐处理的菌株抗氧化酶活性明显高于对照菌株。

5.3 pH

pH作为比较容易变化的水体生态环境因子，对水质和水生生物有诸多影响。水体pH变化，不仅影响水中氮磷的转化，还能影响水生生物存活生长、免疫和代谢［35］。pH对栉孔扇贝免疫活性有明显的刺激作用，且在一定范围内随刺激强度的增加呈现免疫活性的正调节;在高强度pH刺激下，扇贝免疫活性呈现出负调节［36］。有研究表明，pH的变化会影响虾蟹从外界吸收氧的能力，进而影响其耗氧率［37］。极端的 pH环境使水生生物血液酸碱平衡紊乱，会导致离子调节机制、气体交换以及血氧输送等功能丧失，造成缺氧症，严重者甚至危及生物体存活。一般而言，pH很少单独对水中生物有直接危害作用，但在特定环境条件下，pH能够和其他环境因子协同作用，间接地对水生生物产生影响［35］，在水生动物中，软体动物最为敏感［38］。哈承旭［39］在研究高 pH 胁迫“黄海1号”中国对虾时发现，“黄海1号”和野生群体在高pH条件下均表现出一定的应激能力，溶菌酶(LSZ)、酚氧化酶(PO)以及SOD活力随pH的升高而增强，在pH 9.4时，两群体中国对虾全部死亡。

5.4 氨氮

水体中的氨氮主要由生物排泄物、残饵以及动植物尸体等含氮有机物经微生物分解产生，大量的有毒物质(氨氮、硫化氢以及亚硝酸氮等)会导致养殖生物缺氧或中毒死亡。目前，氨氮已成为水产养殖业中常见的胁迫因子［40］。氨氮在天然水体中以离子铵(NH4+)和非离子氨(NH3)的形式存在，两者在水体中可以相互转化。其中非离子氨可以穿透细胞膜，进而对机体产生毒性效应，而离子氨(NH4+)带有电荷，有较强的水溶性，可以跟水结合成更大的水合离子，很难通过鱼鳃细胞膜［41］。有关氨氮对水生生物产生的生理机制，比较复杂。目前，大多数人认为NH4+升高，取代了K+，从而导致N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体谷氨酸盐感受器过度活化，大量的Ca2+涌入，随后中央神经系统细胞死亡［42］。也有人认为氨氮能够抑制血液载氧能力［40］，最终会因为体内缺氧而导致机体代谢紊乱。曾媛媛等［43］认为，氨氮胁迫显著影响拟穴青蟹各组织器官的SOD和GPX活性，表现为随着氨氮胁迫含量升高和胁迫时间延长，拟穴青蟹各组织器官中SOD和GPX活性下降。陈家长等［44］认为，超过3 mg/L的氨氮质量浓度胁迫能够显著降低罗非鱼的免疫力，增加对海豚链球菌的易感性。由此可见，氨氮不仅能够对水生生物的免疫力造成影响，而且还能加强水生动物对病原菌的易感性。

5.5 污染物

随着工业废水的大量排放，重金属污染已严重影响到水产养殖业的发展，由于水体中过量重金属的存在，严重威胁着水生生物的生长、繁殖及洄游等生物活动。目前，国内外学者关于重金属对水生生物毒害作用的研究较为广泛，涉及到微型藻类、水生植物、桡足类、枝角类、鱼类、贝类等，而以其体内抗氧化酶作为水体污染监测指标的研究已成为热点。张红霞等［45］通过重金属离子对日本蟳血淋巴抗氧化酶的研究发现，在低浓度重金属离子影响下，日本蟳血淋巴中SOD活力一直呈激活状态。而高浓度组 SOD活力在短时间内激活后受到抑制，4种重金属离子对日本蟳血淋巴SOD、GPX活力的毒性大小为Hg2+＞Cd2+＞Cu2+＞Pb2+，认为出现这种差别的原因是生物体对不同重金属离子的需求有所差异而且不同重金属离子对组织中抗氧化酶的致毒机理不同。研究发现，在重金属离子胁迫下，灵芝菌［46］、南极细菌［47］、酵母菌［48］和苜蓿中华根瘤菌［49］等微生物体内的抗氧化酶活性均有不同程度的升高，以减少细胞受到的损伤。

苯酚类等持久性有机化合物有很强的毒性，是当今环境中重要的污染物之一，极易在水体环境中不断积累并通过食物链传递，严重威胁着生态环境以及人类的健康。彭金良等［50］研究了普通小球藻的生长、光合色素和MDA含量及抗氧化酶(SOD、CAT、POD)活性在 α-萘酚胁迫下的变化规律，结果发现，随着 α-萘酚浓度的升高，藻的SOD、CAT、POD活性均先升高后下降，MDA含量在3种抗氧化酶活性不同程度下降后才会急剧上升，膜受脂质过氧化作用的损伤程度加剧。认为普通小球藻的致毒机制之一是α-萘酚导致膜脂过氧化，而在污染物胁迫下，抗氧化酶具有防御保护细胞的作用。除此之外，海洋微藻还对于BDE-47有较高的敏感性，可产生应激反应，通过增强体内SOD和CAT活性以减少藻细胞自身的危害［51］。

张辰佳等［52］研究了3种酚类对多刺裸腹溞GST和AChE活力的影响，发现短时间内(24 h)低浓度酚类化合物对GST和AChE活力具有诱导作用，但随着酚类化合物处理浓度的升高和处理时间的延长，酶活力受到显著抑制。由此说明，环境中的有机污染物会对水生生物产生氧化胁迫，抗氧化防御系统可以作为生物标志物来检测海洋环境中有机污染物对水生生物的生化毒性。

综上所述，自由基和ROS在生物体生理代谢过程中以及环境污染的毒害机制中发挥了重要作用，许多研究者对水生生物进行了广泛的研究，将对水生生物抗氧化酶防御系统的影响作为生物标志物应用到环境的监测中。从目前的研究看，关于生物体内抗氧化酶的研究主要集中于对抗氧化酶活性以及相关基因表达及分子进化［53］、基因重组［54］的研究。其中枝角类、桡足类在环境胁迫后抗氧化酶活性的研究较少，对于其在免疫应答中的具体作用机制的研究更是微乎其微。为了今后养殖生物活饵料的大规模发展，这些饵料生物对环境因子的响应机制将会成为国内外学者研究的热点。

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