藤茶抗氧化活性研究

欧贤红，叶 勇 ，黄秋洁，刘华钢，宋云飞

1泸州医学院，泸州 646000;2桂林医学院药学院，桂林 541004;3广西医科大学药学院，南宁 530021;4桂林莱茵生物科技股份有限公司博士后工作站，桂林 541100;5广西中医药大学药学院，南宁 530001

藤茶系葡萄科蛇葡萄植物显齿蛇葡萄［Ampelopsis grossedntata(Hand-Mazz)W.T.Wang］的茎叶，该植物总黄酮含量丰富［1］。研究表明［2］，黄酮类化合物的抗衰老、抗突变、抗动脉粥样硬化等作用都与其抗氧化活性有关。藤茶总黄酮具有较强的抗氧化活性，可清除氧自由基，并能预防性对抗超氧阴离子自由基引起的氧化性损伤［2，3］。藤茶黄酮类化合物包括杨梅素、二氢杨梅素、福建茶素、杨梅黄素、杨梅苷等，其中二氢杨梅素含量较高［1］。据报道［3，4］，杨梅素和二氢杨梅素清除DPPH·的活性均强于芦丁，其中二氢杨梅素的抗氧化活性还强于Vit C和常用的人工合成抗氧化剂叔丁基对苯二酚(TBHQ)。张晓元等［5］采用ESR和自旋捕集技术测定二氢杨梅素对·OH、和DPPH·的清除效果。结果表明，二氢杨梅素清除自由基的能力是＞DPPH·＞·OH。该研究结果与徐静娟等［6］采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法、抗坏血酸-Cu2+-H2O2体系法和亚油酸体系法的研究结果一致。此外，二氢杨梅素对动物油和植物油均有很强的抗氧化作用。而杨梅素无论对水溶性食品或脂溶性食品，均能发挥很好抗氧化作用，作用明显强于合成抗氧化剂3，5-二叔丁基-4-羟基甲基苯(BHT)和芦丁［7］。因此，二氢杨梅素和杨梅素可作为天然抗氧剂应用于食品保藏。

以往研究杨梅素和二氢杨梅素的抗氧化活性大多采用紫外分光光度法［4，6，7］。对藤茶总黄酮、杨梅素和二氢杨梅素在DPPH·、氧自由基()和羟自由基(·OH)体系中的抗氧化活性尚未见报道。因此，为进一步明确藤茶不同提取物藤茶总黄酮、二氢杨梅素和杨梅素的抗氧化活性，本文采用酶标仪法检测了藤茶总黄酮、二氢杨梅素和杨梅素对·OH、O2-·和DPPH·的清除效果并，比较它们清除自由基的能力。

1 仪器与材料

1.1 仪器

酶标仪(型号VersaMax)。

1.2 药品与试剂

藤茶总黄酮、二氢杨梅素和杨梅素(均为自制，含量分别为74%、90%、83%，以1%DMSO超声溶解成适宜浓度备用;DPPH·样品(Sigma公司);邻苯三酚、硫酸亚铁(FeSO4)、乙醇、盐酸(HCl)、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、邻二氮菲(均为分析纯)。

2 实验方法

2.1 DPPH·体系

［8］，并稍作改进:取0.5 mL不同浓度样品液于离心管中，加入0.5 mL 0.08 mg/mL的DPPH·溶液(准确称取20 mg DPPH·，加60%乙醇溶解于小烧杯中，移至250 mL容量瓶，定容)，混匀，取200 μL置于96孔板中，共3孔，静置30 min，于517 nm处测定吸光度Ai;同时测定0.5 mL DPPH·溶液与0.5 mL 60%乙醇混合溶液的吸光度Ac;0.5 mL提取液与0.5 mL 60%乙醇混合溶液的吸光度Aj。采用维生素C(Vit C)作为阳性对照药按照同法进行测试。根据以下公式计算抑制率:抑制率={1-(Ai-Aj)/Ac}×100%，抑制率越大，则表示该试样的抗氧化活性越强。实验重复3次。

2.2 ·OH 体系［9］

取0.1 mL 7.5 mmol/L邻二氮菲溶液置于1 mL离心管中，加入0.2 mL 0.2 mol/L pH 7.4 的磷酸盐缓冲液(PBS)，混匀后加入 0.1 mL 7.5 mmoL/L 的FeSO4溶液，充分混匀后加入0.1 mL 0.1%H2O2溶液，然后加双蒸水补足到1 mL，混匀，取200 μL置于96孔板中，共3孔，在37℃水浴下反应1 h后，以536 nm波长下测定吸光度A(损害)。同上法，不加入H2O2和样品溶液测定A(未损害)。方法同2.1，分别加入不同浓度的样品溶液0.1 mL后加H2O2，测536 nm时的吸收值，即得 A样。重复3次。采用等浓度的Vit C作为阳性对照药按照同法进行测试。按下式计算·OH清除率:·OH清除率(S%)=(A样-A损害)/(A未损害-A损害)×100%。

取 2.7 mL PBS(pH 8.2)，加0.2 mL 蒸馏水，邻苯三酚0.1 mL。混匀，于25℃保温，4 min后加入10 mol/L HCl一滴终止反应。取200 μL置于96孔板中，共3孔，于325 nm处测吸光度A0。测定样品清除能力时，取2.7 mL PBS，加0.2 mL 不同浓度的样液，0.1 mL的邻苯三酚，混匀于25℃保温，4 min后加入10 mol/L HCl一滴终止反应。于325 nm处测吸光度Aj。采用等浓度的Vit C作为阳性对照药按照同法进行测试。清除率计算公式:S=［1-(Aj-Ai)/A0］×100%，Ai为样液吸光度。实验重复3次。

2.4 数据统计方法

3 实验结果

3.1 对DPPH·的清除活性

以水溶性抗氧化剂Vit C作对照，研究了藤茶总黄酮、二氢杨梅素、杨梅素对DPPH·的清除作用，结果见图1。由图1可知，藤茶总黄酮、二氢杨梅素、杨梅素对DPPH·具有很明显的清除作用，三者的清除效果均比同浓度的Vit C效果好，且呈量效关系。由表1可以看出，藤茶总黄酮、二氢杨梅素、杨梅素清除DPPH·的IC50值为均大于Vit C，其中杨梅素的IC50值比藤茶总黄酮、二氢杨梅素的小，提示杨梅素的清除DPPH·效果优于藤茶总黄酮、二氢杨梅素。

图1 藤茶不同提取物对DPPH·的清除作用Fig.1 DPPH· scavenging activities of different extracts of A.grossedntata

3.2 对·OH的清除活性

由图2可知，在10～80 mg/L浓度范围内，藤茶各提取物的抗氧化活性大小为:杨梅素＞二氢杨梅素＞藤茶总黄酮＞Vit C。但在200～400 mg/L浓度范围内藤茶各提取物对·OH的清除活性弱于Vit C。

图2 藤茶不同提取物对·OH的清除作用Fig.2 ·OH scavenging activities of different extracts of A.grossedntata

3.3 对 O2-· 的清除活性

如图3和表1所示，藤茶不同提取物藤茶总黄酮、杨梅素和二氢杨梅素清除的作用明显强于Vit C，且二氢杨梅素的清除作用优于藤茶总黄酮和杨梅素，其 IC50为3.88 ±0.99 mg/L。

图3 藤茶不同提取物对·的清除作用Fig.3 ·scavenging activities of different extracts of A.grossedntata

表1 藤茶不同提取物的抗氧化活性(，n=3)Table 1 Antioxidant activities of different extracts of A.grossedntata(，n=3)

表1 藤茶不同提取物的抗氧化活性(，n=3)Table 1 Antioxidant activities of different extracts of A.grossedntata(，n=3)

注:与Vit C比较，1)P ＜0.05;与藤茶总黄酮比较，2)P ＜0.05;与二氢杨梅素比较，3)P ＜0.05;“-”无法计算IC50Note:Compare with Vit C，1)P ＜0.05;Compare with total flavonoid，2)P＜0.05;Compare with dihydromyricetin，3)P ＜0.05;“ － ”IC50cannot be calculated

IC50(mg/L)样品Samples 体系System藤茶总黄酮 Total flavonoid 3.32 ±0.181) 5.22 ±3.751)DPPH·体系DPPH·System O-·2杨梅素 Myricetin 2.91 ± 0.281，2，3)5.02 ±0.091，3)二氢杨梅素 Dihydromyricetin 3.76 ±0.081) 3.88 ±0.991)Vit C Control 5.63 ±1.15 －

4 讨论

藤茶总黄酮、杨梅素和二氢杨梅素具有较强的抗氧化活性。藤茶总黄酮清除黄嘌呤(黄嘌呤氧化酶系统产生的的 IC50为 14.7 mg/L［3］。在 0.5～10.0 mg/mL范围内，藤茶总黄酮的抗活性氧能力呈量效关系，70 mg/mL藤茶总黄酮的抗氧化能力超过维生素E和Vit C［2］。本文采用邻苯三酚自氧化法测得藤茶总黄酮清除的 IC50为(5.22 ±3.75)mg/L，在1.0 ～20.0mg/L 范围内，对的抑制率高于同等浓度的Vit C，并呈量效关系。此外，本文结果显示藤茶总黄酮清除DPPH·的IC50为 (3.32±0.18)mg/L，在2.0 ～ 10.0 mg/L 范围内，对 DPPH·的抑制率高于同等浓度的Vit C，并呈量效关系;在10 ～200.0 mg/L范围内，对·OH的抑制作用呈量效关系，其抑制率高于同等浓度的Vit C。据报道［3，4］，杨梅素和二氢杨梅素清除 DPPH·的 IC50值分别为 18.34、10.70 μg/mL，它们的抗氧化活性均强于阳性药芦丁(IC50=31.32 μg/mL)，其中二氢杨梅素还强于Vit C和常用的人工合成抗氧化剂叔丁基对苯二酚(TBHQ)。但是，本实验测得杨梅素和二氢杨梅素清除 DPPH·的 IC50值分别为(2.91 ±0.28)、(3.76 ±0.08)mg/L，它们的抗氧化活性均强于阳性药Vit C。张晓元等［5］采用ESR和自旋捕集技术测定二氢杨梅素对·OH、和DPPH·的清除效果。结果表明，二氢杨梅素清除、·OH 和 DPPH·的 IC50分别为 7.4、297.8 和 12.4 μg/mL，表明二氢杨梅素对的清除作用更强。该研究结果与徐静娟等［6］采用NBT光化还原法、抗坏血酸-Cu2+-H2O2体系法和亚油酸体系法的研究结果一致(二氢杨梅素对不同自由基的清除能力是O2-·＞·OH＞脂过氧自由基ROO·)。为进一步明确藤茶不同提取物藤茶总黄酮、二氢杨梅素和杨梅素的抗氧化活性，我们采用酶标仪检测了藤茶总黄酮、二氢杨梅素和杨梅素对·OH、和DPPH·的清除效果并比较它们清除自由基的能力，结果二氢杨梅素对DPPH·和的清除作用强于·OH，杨梅素对不同自由基的清除能力是DPPH·＞＞·OH;不同藤茶提取物对清除能力是二氢杨梅素＞杨梅素＞藤茶总黄酮，对·OH清除能力是杨梅素＞二氢杨梅素＞藤茶总黄酮，对DPPH·清除能力是杨梅素＞藤茶总黄酮＞二氢杨梅素。是生成其它活性氧自由基的前体，清除就意味着能控制其它活性氧自由基的形成［10］，因此，本文实验结果提示杨梅素和二氢杨梅素是藤茶总黄酮中主要抗氧化活性成分。

二氢杨梅素对动物油和植物油均有很强的抗氧化作用。杨梅素无论对水溶性食品(饮料、冷饮、维生素C)或脂溶性食品(食用油脂、乳脂、人造奶油、蛋黄酱、维生素D)，均能发挥很好抗氧化作用，特别在护色、防止油脂酸败和香气劣化等方面，具有很强优越性，作用明显强于合成抗氧化剂3，5-二叔丁基-4-羟基甲基苯(BHT)和芦丁［7］。因此，二氢杨梅素和杨梅素可作为天然抗氧剂应用于食品保藏。但是，二氢杨梅素在藤茶中含量高，且广泛存在于多种药食同源的植物中，提取方法简单［1］，比杨梅素更易获得，因此二氢杨梅素比杨梅素更具经济开发价值。

本文明确了二氢杨梅素、杨梅素的抗氧化作用，今后将进一步研究它们的抗氧化作用机制。

参考文献

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