益气温阳活血利水法对心衰大鼠水通道蛋白2 mRNA表达的影响

张晓华 隋殿军 刘淑荣 刘新宇 邸 琳 (吉林省中医药科学院，吉林 长春 3002)

心力衰竭水潴留机制的主要途径为心输血量下降，血管加压素水平升高，肾脏集合管V2受体激活，水通道蛋白(AQP)2激活和(或)基因表达上调，水重吸收增加。AQP 2主要受精氨酸加压素(AVP)调控，而AVP通过肾脏V2受体调控AQP2，故AVP-V2受体-AQP2系统在调节机体水液代谢中起着重要作用〔1〕。益气温阳活血利水法是目前公认的治疗心衰的方法，本实验拟了解益气温阳活血利水法对于心衰水潴留的作用机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象 Wistar大鼠，180～220 g，购自吉林大学实验动物中心;动物等级Ⅱ级;合格证编号为 SCXK-(吉)2008-0005。阿霉素按3 mg/kg的剂量溶于1 ml生理盐水，腹腔注射，1次/w，共6 w，同时对大鼠进行睡眠剥夺(连续5 d，0.5 h闹钟响1次)。正常对照组注射等体积生理盐水，6 w后通过观察模型组大鼠的心衰症状(活动量、食欲、发绀、水肿、尿量)及左室舒张末压等指标判断心衰是否造模成功，以左室舒张末压≥15 mmHg为心衰造模成功的主要指标〔2〕。

1.2 药物及仪器

1.2.1 药物 益气活血利水胶囊，内容物为深棕色膏状，5.503 6 g生药/g膏。由吉林省中医药科学院资源所提供。益气温阳活血利水胶囊人参、制附子、黄芪、桂枝、丹参、车前子、葶苈子、五加皮等药物组成。阳性药:芪苈强心胶囊，石家庄以岭药业股份有限公司生产，批号:20120228。

1.2.2 主要仪器与试剂 SYBRGreen PCR试剂盒(ABI公司);Real-time PCR检测仪(ABI-7300 ABI美国);PCR扩增仪。采用GAPDH为内参照，登陆NCBI(美国国立生物技术信息中心)查找大鼠V2R、AQP2及GAPDH的基因序列，用CmSuite8引物设计软件设计V2受体、AQP2及GAPDH的上下游引物。AQP2上游引物5'TTGGTCTGGGCATCGGCATC 3'，下游引物5'GCTGTGGCGTTGTTGTGGAG 3'，扩增片段长度238 bp;V2R上游引物 5'AGCAACAGCAGCCAGGAGGAAC 3'，下游引物 5'AACAGAGCCACAGCCAGGTCAG 3'，扩增片段长度 212 bp;GAPDH上游引物5'GTCGGTGTGAACGGATTTG 3'，下游引物5'TCCCATTCTCAGCCTTGAC 3'，扩增片段长度181 bp。

1.3 方法

1.3.1 分组及给药 将造模成功的心衰大鼠，随机分为模型组，芪苈强心组、中药高、中、低剂量组(每组保证存活10只)，与对照组共6组。对照组、模型组分别灌胃10 ml/kg蒸馏水;阳性中药组灌胃0.65 g/kg芪苈强心胶囊;高、中、低剂量组分别灌胃益气活血利水胶囊30、15、7.5生药g/kg;连续灌胃给药1个月。

1.3.2 标本采集 组织标本:灌胃4 w后，将大鼠断头处死，腹部正中切口，切开皮肤、肌肉、筋膜、腹膜，将肾组织周围内脏推向两侧，迅速取近髓肾组织，切半，一半浸泡在10%甲醛中固定48 h备用;一半置于－80℃冰箱中备用。

1.3.3 大鼠肾脏组织V2R及AQP 2 mRNA表达的影响 通过组织总 RNA抽提、逆转录 cDNA、将制备好的 cDNA进行PCR扩增，然后分别取PCR扩增产物10 μl在1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳终止后，用凝胶成像系统进行扫描、拍照，采用仪器自带软件(ABI Prism 7500 SDS Software)分析产物CT值，计算ΔCT值，并以GAPDH内参照CT值进行标准校正并通过软件计算PCR产物的相对表达量。

1.4 统计学方法 应用SPSS13.0软件进行统计学分析，计量资料用±s表示，组间比较用t检验，多组间用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

与对照组比较，模型组的V2R、AQP2 mRNA相对表达量均升高(P＜0.01，P＜0.05)，提示心衰时 V2R、AQP2 mRNA 相对表达增加;与模型组比较，各给药组均使V2R表达不同程度的下调(P＜0.01)，使AQP2表达下调，其中中药中、高剂量组有统计学差异(P＜0.05)。见表1。

表1 益气温阳活血利水法对心衰大鼠V2R、AQP2 mRNA表达的影响(±s，n=6)

表1 益气温阳活血利水法对心衰大鼠V2R、AQP2 mRNA表达的影响(±s，n=6)

与对照组比较:1)P ＜0.01，2)P ＜0.05;与模型组比较:3)P＜0.01，4)P＜0.05

组别 对照组 模型组 芪苈强心组 中药低剂量组 中药中剂量组 中药高剂量组AVP V2R 0.011 8±0.006 72)0.036 8±0.014 91)0.009 7±0.003 23)0.010 6±0.003 53)0.011 0 ±0.002 73)0.011 1±0.008 23)AQP2 0.011 4±0.010 94)0.045 2± 0.019 22)0.027 6± 0.021 0 0.029 6±0.008 6 0.016 0±0.005 94)0.015 3±0.003 54)

3 讨论

心衰是由不同病因引起的心脉“气力衰竭”，心体受损，心动无力，血流不畅，逐渐引起诸脏腑功能失调，进而出现心悸、喘促、尿少、浮肿等为主要表现的危重病证〔3〕。中医学认为心衰的病机主要沿着气虚-气阳两虚-气(阳)虚血瘀-气(阳)虚血瘀、痰浊水结的发展演变规律〔4，5〕，病性属本虚标实，“虚”、“瘀”、“痰”、“水”等在心衰发病中起到很主要的作用〔6〕，气阳亏虚，血瘀水结是慢性心力衰竭的病机关键，益气温阳，活血利水是慢性心力衰竭的治疗大法。近些年中医学对于心衰的研究日趋增多，中医药治疗心衰的优势也日趋显现。

AQP2在肾脏集合管主细胞的管腔侧膜和胞质的囊泡内表达，主要由AVP调控，在调节机体水液代谢中起着重要作用〔7〕，AVP-V2受体-AQP2是调节水代谢的一个系统，在整个系统中每个环节出现异常均可影响水液的代谢。心衰时AVP水平升高，V2受体及AQP2均异常表达。本实验表明益气温阳活血利水法可降低心衰时升高的AVP V2受体及AQP2 mRNA的表达，从而改善体内水潴留。

1 许顶立，任 昊.充血性心力衰竭水潴留的机制-Aquaporin 2水通道蛋白的作用〔J〕.生理科学进展，2000;31(2):150-2.

2 张兴平，陈庆伟.慢性心力衰竭大鼠血清细胞因子的变化及其与左室舒张末压的相关性〔J〕.中国老年学杂志，2007;27(14):1348-9.

3 黄永生.中医内科教学与临床〔M〕.北京:人民卫生出版社，1999:87.

4 唐蜀华.中医药治疗充血性心力衰竭的临床体会〔J〕.上海中医药杂志，2003;37(1):23-5.

5 黄平东.中医古籍对心力衰竭的论述探要〔J〕.中医药学刊，2003;21(4):592-3.

6 李立志.陈可冀治疗充血性心力衰竭经验〔J〕.中西医结合心脑血管病杂志，2006;4(2):136-8.

7 Beitz E.The mammalian aquaporin water channel family:a promising new drug target〔J〕.Curr Med Chem，1999;6(6):457-67.