盐酸椒苯酮胺致突变实验

陈阳述 李茹冰 李 健 吴新荣 孙智平 陈 新 万华印

(解放军第四五八医院全军肝病中心，广东 广州 510602)

盐酸椒苯酮胺(PPTA)为我国原始创新的心血管化学药，是钙增敏剂类强心药及心肌保护剂〔1〕。临床前研究发现，其具有良好的保护受损心肌、增强心功能并降低心肌耗氧量的双重作用;可增加心肌收缩蛋白对Ca2+的敏感性，而不增加心肌细胞内Ca2+浓度，甚至有抗Ca2+超载作用，无致心律失常的危险〔2，3〕;可通过开放血管平滑肌细胞钙敏感钾离子通道产生舒张血管作用;药物代谢快，不会在体内积蓄〔4〕。目前国内外尚无同类药物，已获得SFDA颁发的1.1类化学药品临床试验批件。为评价其安全性，需了解它有否致突变作用，课题组依据中国药典2005年版二部及新药(西药)临床前研究指导原则汇编(药学、药理学、毒理学)的有关技术要求，进行了盐酸椒苯酮胺Ames试验、小鼠微核试验及中国仓鼠肺细胞染色体畸变试验。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试药与动物 盐酸椒苯酮胺:中国医学科学院药物研究所药物化学室合成，批号88102，纯度 (99±0.5%)。阳性对照品 2，7，-2-氨基芴(2，7-2AF)，2-氨基芴(2-AF)，9-芴酮，甲基甲烷磺酸酯(MMS)，正定霉素(DMC)，Vp16，环磷酰胺(CP)，上海第十二制药厂生产;卡铂(Carboplatin)，山东齐鲁药厂生产;均为化学纯。试验菌株:组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏杆菌TA97、TA98、TA100和TA102系中国医学科学院药物研究所保存菌种，经检定符合要求后冻存于-80℃冰箱。代谢活化剂自行制备。

1.1.2 实验动物 雄性昆明种小鼠，体重22～25 g，中国医学科学院实验动物所。中国仓鼠肺细胞(CHL)，中国医学科学院药物研究所保存。

1.2 方法

1.2.1 回复突变试验(Ames试验) 参照鼠伤寒沙门氏杆菌/哺乳动物微粒体酶致突变试验方法，对盐酸椒苯酮胺进行非代谢活化和代谢活化的平板参入检测。从液氮罐中取出菌种，37℃ 水浴融化后接种到营养肉汤中，37℃ 恒温振荡培养12 h。试验药物盐酸椒苯酮胺共设7个剂量组，分别为 0.1、1、5、10、20、100、1 000 μg/皿。另设空白对照组和阳性对照组。非活化系统(加0.5 ml PBS)和活化系统(加0.5 ml S9混合液)并加入0.1 ml不同浓度的菌液及0.1 ml不同浓度的盐酸椒苯酮胺，混匀后倒入平板铺平。每个剂量2皿。各种菌的阳性对照组加相应的阳性诱变剂。将所有培养皿倒置于(37±1)℃培养箱中孵育48 h，计数每皿回变菌落数。以回变菌落数超过对照组2倍以上视为Ames阳性。

1.2.2 盐酸椒苯酮胺的小鼠骨髓细胞微核试验 预试验:以盐酸椒苯酮胺58.5 mg/kg，按0.2 ml/10 g体重静脉注射。分别在给药后18、24、30、48及72 h后处死3只小鼠，取股骨骨髓制片，Giemsa染色，计数1 000个嗜多染红细胞数和含微核的嗜多染红细胞数，以千分率表示。结果显示，对照组与各采样点的微核率无显著差异，故正式实验时采用给药后24 h取骨髓制片。

正式试验:将30只小鼠按体重随机分成5组，每组6只。设盐酸椒苯酮胺3个剂量组，分别为58.5、29.0、14.5 mg/kg;另设正常对照组及阳性对照组(环磷酰胺50 mg/kg腹腔注射1次)。药物均用15%丙二醇配制，以0.2 ml/10 g体重尾静脉注射。给药后24 h处死小鼠，取股骨骨髓涂片，甲醇固定，Giemsa染色。观察计数1 000个嗜多染红细胞含有微核细胞数(MNPCE)。

1.2.3 哺乳动物细胞染色体畸变试验 预试验:50%细胞生长抑制试验:每个培养瓶接种6×104个细胞，培养24 h后，加入5个不同浓度的盐酸椒苯酮胺，培养48 h，换以新鲜培养液继续培养9 d后弃液。甲醇冰醋酸固定，Giemsa染色，计数每瓶集落数，然后以药物浓度的对数为横坐标，细胞生长率为纵坐标作图，求得盐酸椒苯酮胺抑制细胞生长50%的浓度为8.0 μg/ml，以它作为正式实验的最高浓度。

正式试验:实验设3个剂量组，终浓度分别为盐酸椒苯酮胺8、2、0.5 μg/ml，另设阳性对照组及阴性对照组。活化系统中所含0.5 ml S9混和液于作用6 h后去除，换新培养甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定3次，制片，空气干燥，Giemsa染色10 min。每组观察计数100个中期细胞分裂相，观察并记录染色体数目和结构情况畸变。

2 结果

2.1 盐酸椒苯酮胺的Ames试验 见表1。从表中可以看出不论加与不加S9混合物，各阳性诱变剂回变菌落数均超过空白对照组2倍;盐酸椒苯酮胺每皿浓度为100和1 000 μg时，对4菌株均有抑菌毒性，其余各剂量组均在正常范围内波动，故判定盐酸椒苯酮胺的Ames试验结果为阴性。

表1 盐酸椒苯酮胺Ames试验结果(±s，n=2)回变菌落数/皿

表1 盐酸椒苯酮胺Ames试验结果(±s，n=2)回变菌落数/皿

药物(μg/皿) TA 97TA 98TA 100TA 102－S9 +S9－S9 +S9－S9 +S9－S9 +S9 216±6 242±5 27±0 38±6 143±0 157±10 353±10 578±20 0.1 205±1 218±10 22±6 38±6 137±20 177±13 336±23 387±15 1 215±2 242±10 21±0 36±2 171±7 178±8 353±13 539±5 5 150±5 203±7 16±1 22±4 218±0 189±1 139±5 362±8 10 182±14 232±2 － 42±6 134±9 193±13 75±19 407±0 20 123±8 16±1 110±0 165±3 － 359±1 100 1 000 9-芴酮 0.2 983±10 2，7-2AF 20 509±20 2AF 10 1 736±509 1 360±40 DMC 20 1 440±0 MMS 2.0 μl 6 740±370 1 606±48 PPTA 0 Vp16 1.0 mg 1 270±37

2.2 盐酸椒苯酮胺的小鼠骨髓细胞微核试验 见表2。从表中可以看出环磷酰胺阳性组与对照组相比较，微核率显著增高(P＜0.001)，而各给药组的微核率分别与对照组相比较，无显著性差异(P＞0.05)。说明盐酸椒苯酮胺的小鼠骨髓微核试验结果为阴性。

2.3 盐酸椒苯酮胺对CHL细胞染色体试验 结果见表3。从表中看出，阳性药组与对照组比较，畸变率明显升高，具有极显著差异(P＜0.001)。而盐酸椒苯酮胺各剂量组对CHL细胞染色体的畸变率与对照组相似，均在正常范围。表明盐酸椒苯酮胺对CHL细胞染色体的畸变率在正常范围内，故试验结果为阴性。

表2 盐酸椒苯酮胺的微核试验结果(±s)

表2 盐酸椒苯酮胺的微核试验结果(±s)

药物 n 微核率(‰) P/N P值6 1.66±0.67 40/60盐酸椒苯酮胺14.5 mg/kg 6 1.17±0.31 36/64 ＞0.05 29.0 mg/kg 6 0.83±0.31 42/58 ＞0.05 58.5 mg/kg 6 1.00±0.37 35/65 ＞0.05环磷酰胺15%丙二醇50.0 mg/kg 6 38.20±3.00 30/70 ＜0.001

表3 盐酸椒苯酮胺的染色体畸变试验结果

3 讨论

PPTA是中国自主研发的钙增敏剂类强心药及心肌保护剂，具有完全自主知识产权，药物物质及其合成工艺、适应证、中间体合成工艺、制剂及单晶等5个发明专利均获授权〔5～7〕。目前已完成Ⅰ期临床试验，结果显示该药的人体耐受性良好、临床药代动力学特征与临床前实验一致。盐酸椒苯酮胺Ames试验通过检测鼠伤寒沙门氏菌回变菌落数，来推断盐酸椒苯酮胺是否存在引起基因突变的遗传毒性;小鼠微核试验通过静脉给予小鼠盐酸椒苯酮胺后，观察小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率的变化，从而来推断受试物的致突变性;中国仓鼠肺细胞染色体畸变通过观察中国仓鼠肺细胞染色体形态、结构及数量是否改变来推断盐酸椒苯酮胺是否存在有引起染色体畸变的遗传毒性。3项试验均阴性说明盐酸椒苯酮胺无致突变作用。

1 杨向阳，李若冰，万华印.新型钙增敏剂左西孟旦和盐酸椒苯酮胺研究进展〔J〕.国际药学研究杂志，2010;37(1):32-5.

2 万华印.心血管化学创新药盐酸椒苯酮胺(PPTA)〔EB/OL〕.(2004206230)〔2009208201〕.

3 李茹冰，万华印，邓凤君，等.心血管创新药盐酸椒苯酮胺//中国药理学会药学监护专业委员会第一届第四次学术研讨会论文摘要汇编〔C〕.北京:中国药理学会，2008:44.

4 牟 英，孟志云，窦桂芳.椒苯酮胺在比格犬体内的药代动力学研究〔J〕.中国血液流变学杂志，2006;16(3):338-40.

5 万华印，李茹冰，周力践.椒苯酮胺、椒苯酮胺盐及其制备方法:中国，ZL 02125318.8〔P〕.2004209201.

6 万华印，李茹冰，周力践.椒苯酮胺或其盐用作制备治疗心血管疾病药物的应用:中国，ZL02125316.1〔P〕.2005206215.

7 万华印，李茹冰，周力践.N-甲基胡椒乙胺盐的制备方法:中国，ZL 02125317.X〔P〕.2004209215.