血管内皮生长因子对血管内皮细胞ADAMTS5、ADAMTS4及MMP-9表达的影响

李 蕾 陈黎明 赵传艳 崔连群 (山东大学附属省立医院心内科，山东 济南 250012)

血管内皮生长因子 (VEGF)是目前发现的最重要的血管形成促进剂之一。已有报道用于缺血性心脏病的治疗〔1～3〕。刺激VEGF分泌的主要因素有缺血、缺氧、炎症因子等，最主要的因素之一是缺血、缺氧〔4〕。VEGF与基质金属蛋白酶(MMPS)之间可能有相互促进作用。含iv型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶 (ADAMTS)与MMPS同属于金属蛋白酶家族，其中ADAMTS4、ADAMTS5均能降解蛋白聚蛋白多糖。目前尚无VEGF对体外培养内皮细胞MMPs及ADAMTS4、ADAMTS5表达的报道。本实验模拟冠心病缺血缺氧状态下VEGF分泌增加，且与缺血缺氧严重程度分泌相一致，观察VEGF对内皮细胞MMP-9及ADAMTS4、ADAMTS5表达及活性的影响，探讨VEGF和MMP-9、ADAMTS-5、ADAMTS4的作用及其与动脉粥样硬化斑块稳定之间的可能关系。

1 材料与方法

1.1 试剂 人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)，rhVEGF165(PEPROTECH公司)，RPMI-1640培养基、血清、胰酶(Hyclone公司)，RNAiso Plus(TaKaRa)，RT-PCR 试剂盒(TaKaRa)，SYBR GreenI RT-PCR试剂盒(TaKaRa)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)，RIPA 裂解液(强)(碧云天)，PMSF(碧云天)，4倍蛋白上样缓冲液(Solarbio)，PVDF 膜，ADAMTS4、ADAMTS5、MMP-9单克隆抗体(R＆D SYSTEM)，GAPDH一抗(杭州贤至科技)，抗鼠辣根过氧化物酶标记二抗 (北京中杉)，BeyoECL Plus化学发光试剂盒(碧云天)。

1.2 仪器 美国Specltramax酶标仪，倒置显微镜，DM4000B光学显微镜，QwinV3图像分析软件(德国Leica公司)，日本Image Reader LAS-4000凝胶成像仪，Multi gaugeV3.2图像分析软件，美国Bio-Rad PCR仪，Light Cycler 480Ⅱ PCR仪。

1.3 血管内皮细胞培养 将HUVEC细胞悬浮于完全培养基(10%胎牛血清，90%1640培养基，青链霉素终浓度100 U/ml)恒温温箱37℃孵育培养3 d，传代后，待细胞进入生长力旺盛、状态良好的对数生长期，换用0.5%胎牛血清(BSA)的培养基同时加入 rhVEGF165，使其终浓度为0，10，20，50 ng/ml，恒温孵育培养24 h，分别提取总RNA及细胞总蛋白。

1.4 Real Time-PCR 上述细胞每107个内皮细胞用1 ml RNAiso Plus抽提细胞总RNA，并用分光光度计测量其浓度，用A260/A280值在1.8～2.0确定其纯度，取500 ng总RNA作为模板，照逆转录试剂盒说明书合成第一链cDNA，取稀释3倍后的 cDNA 5 μl为模板，加入 ADAMTS4、ADAMTS5、MMP-9、β-ac-tin上下游引物各1 μl及10 μl SYBR Green荧光定量PCR体系，95℃ 5 s;95℃ 5 s，60℃ 20 s，72℃ 1 min，45 个循环;并进行溶解曲线测试。应用Light Cycler 480Ⅱ 系统扩增，结果采用2－ΔΔct分 析。ADAMTS-5，上 游 5'-TCGTAGGTCTGTCCTGGGAGTTC-3'，下 游 5'-AATGCACTTCAGCCACCATCA-3';ADAMTS-4上游5'-GACACGCTGGGTATGGCTGA-3'，下游5'-ACTGATGCATGGCTTGGAGTTG-3';MMP-9上游5'-AATCTCACCGACAGGCAGCT-3'，下游 5'-CCAAACTGGATGACGATGTC-3';β-actin上游5'-TGGCACCCAGCACAATGA A-3'，下游5'-CTA AGTCAT AGT CCG CCT AGA-AGCA-3'。

1.5 Western印迹 提取上述细胞总蛋白，测浓度后蛋白变性，取蛋白50 μg加入4倍蛋白上样缓冲液总体积约10 μl上样，以5%浓缩胶、10%分离胶进行SDS-PAGE凝胶电泳，70 V，30 min，预电泳，30 V，60 min，一阶段电泳，100 V，70 min 二阶段电泳，至溴酚蓝迁移至凝胶底部后，100 V，90 min转移至PVDF膜，10%牛奶封闭1 h，加入 AMAMTS5(1∶250)一抗、ADAMTS4(1∶200)一抗、MMP9(1∶200)、β-Actin(1∶800)一抗 4℃摇床上孵育过夜，PBST洗膜 10 min×3，加 HRP标记羊抗鼠 IgG(1∶10 000)，室温摇床上孵育 1 h，PBST 洗膜 10 min ×3，Image Reader LAS 4 000显影仪上进行发光显影，并进行分析，测定各蛋白平均光密度值，并求得各蛋白带与β-actin比值。

1.6 统计学方法 统计软件采用SPSS17.0，数据用±s表示，不同组间比较采用one way-ANOVA分析。

2 结果

2.1 ADAMTS5、ADAMTS4、MMP-9蛋白表达变化 不同处理组间，随着 rhVEGF165 刺激浓度 0，10，20，50 ng/ml的提高，ADAMTS5、ADAMTS4、MMP-9蛋白表达逐步升高(P ＜0.05)。见图1。

图1 ADAMTS5、ADAMTS4、MMP-9蛋白表达水平

2.2 ADAMTS5、ADAMTS4、MMP-9在转录水平表达变化 不同处理组间，随着 rhVEGF165 刺激浓度0，10，20，50 ng/ml的提高，ADAMTS5、ADAMTS4、MMP-9蛋白表达有增强趋势(P＜0.05)。见图2。

图2 各浓度rhVEGF-65刺激后ADAMTS5、ADAMTS4、MMP-9 转录水平

3 讨论

研究发现在动脉粥样硬化斑块肩部及脂质核心处，MMP-9活性增高，其通过降解纤维帽中的胶原和基质，使纤维帽逐渐变薄，斑块易损性增加〔5〕。ADAMTS4、ADAMTS5结构及蛋白水解作用类似于 MMPs〔6～9〕，最近有研究证实 ADAMTS4在外周血抗原水平随着冠心病严重程度逐渐加重，且与冠状动脉复杂病变的数量存在正相关，活性可被TIMP3阻断，同时表明ADAMTS4通过降解蛋白多糖verican/aggrecan导致斑块不稳定，并阐明了ADAMTS-4在急性冠脉综合征中的诊断价值及其诱导斑块不稳定的机制〔10〕。

VEGF除了能高效的促进内皮细胞的分裂和增殖，抑制多种因素导致的内皮细胞凋亡，使内皮细胞快速修复，并能间接抑制血管平滑肌的增殖迁移〔11〕。本实验首次证实了 VEGF可以促进血管内皮细胞 MMP-9、ADAMTS4、ADAMTS5 mRNA表达及蛋白合成，促进其活性增强。其机制可能为:①随着粥样硬化进展，内皮细胞功能受损，机体缺血缺氧而产生的VEGF，通过多种复杂机制诱导产生蛋白酶，如纤溶酶、纤溶酶原激活物、MMPs、ADAMTS等，使基质蛋白被酶水解，导致斑块易损性增强;②导致动脉粥样斑块不稳定并加速其进展的另一主要机制是斑块内出血，VEGF刺激引起小的、易损血管在进展期斑块内形成，导致斑块内出血，引起急性症状。上述三种蛋白酶作用均可被TIMP3抑制，提示利用TIMP-3生物活性剂阻断ADAMTS5、ADAMTS4、MMP-9有望成为治疗动脉粥样硬化斑块不稳定的一条新途径。

1 Krzysztof K，Lidia C，Maciej D，et al.Intramyocardial plasmid-encoding human vascular growth factor A165/basic fibroblast growth factor therapy using percutaneous transcatheter approach in patients with refractory coronary artery disease(VIF-CAD)〔J〕.Am Heart J，2011;161(6):581-9.

2 Hedman M，Hartikainen J，Syvanne M，et al.Safety and feasibility of catheter-based local intracoronary vascular endothelial growth factor gene transfer in the prevention of postangioplasty and instent restenosis and in the treatment of chronic myocardial ischemia.PhaseⅡresults of the Kuopio angiogenesis trial(KAT)〔J〕.Circulation，2003;107(13):2677-83.

3 Vandervelde S，van Luyn MJ，Rozenbaum MH，et al.Stem cell-relatedcardial gene expression early after murine myocardial infarction〔J〕.Cardiovasc Res，2007;73(4):783-93.

4 Ladoux A，Frelin C.Hypoxia is a strong inducer of vascular endothelial growth factor mRNA expression in the heart〔J〕.Biophys Res Commun，1993;195(2):1005-10.

5 Moreau M，Brocheriou I，Petit L，et al.Interleukin-8 mediates downregulation of tissue inhibitor of metalloproteinase-1 expression in cholesterolloaded human macrophages:relevance to stability of atherosclerotic plaque〔J〕.Circulation，1999;99(5):420-6.

6 Michaela D，Hideaki N，John S，et al.Roughley，MMPs are less efficient than ADAMTS5 in cleaving aggrecan core protein〔J〕.Matrix Biology，2011;30(3):145-53.

7 Glasson SS，Askew R，Sheppard B，et al.Deletion of activeADAMTS5 prevents cartilage degradation in a murine model of osteoarthritis〔J〕.Nature，2005;434(8):644-8.

8 Stanton H，Rogerson，FM，East CJ，et al.ADANTS5 is the major aggrecanase in mouse cartilage in vivo and in vitro〔J〕.2005;434(9):648-52.

9 Gendron C，Kashiwagi M，Lim NH，et al.Proteolytic activities of human ADAMTS-5:comparative studies with ADAMTS-4〔J〕.J Biol Chem，2007;282(16):18294-306.

10 Zha YP，Chen Y，Xu FY，et al.ADAMTS4 level in Patients with stable coronary artery disease and acute coronary syndromes〔J〕.Biomed Pharmacotherapy，2010;64(3):160-4.

11 Watanable Y，Dvorak HF.VEGF inhibies anchorage disruption-induced apoposis in microvessel endothelial cell by inducing scaffold formation〔J〕.Exp Cell Res，1997;233(2):340.