TFAM重组腺病毒的构建及其对骨关节炎软骨细胞的保护作用

廖壮文 黄 彦 梁月屏 吕浩然 张珠江 (广州医科大学附属第二医院骨外科，广东 广州 510260)

关节软骨细胞的过度凋亡是骨关节炎发病的重要病理机制，而软骨细胞的凋亡与线粒体关系密切，线粒体转录因子A(TFAM)是线粒体转录和复制的关键激活子，与细胞凋亡过程相逆〔1〕。TFAM具有调节线粒体DNA的拷贝数，维护线粒体DNA完整、稳定以及促进损伤修复的功能〔2〕。前期研究表明骨关节炎软骨细胞TFAM的表达降低。因此本研究构建含有TFAM基因的重组腺病毒载体，通过转染骨关节炎软骨细胞，以正向增强其在软骨细胞中的表达，观察TFAM在保护软骨细胞退变过程中的作用，为利用TFAM在逆转软骨细胞凋亡、最终治疗骨关节炎提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例来源 选择我院2011年10月至2012年10月的膝关节骨关节炎患者20例，所有病例均符合骨关节炎诊治指南(2007 年版)的诊断标准〔3〕。

1.1.2 主要试剂 携带TFAM基因的重组腺病毒(Ad-TFAM)由本实验室构建及扩增纯化，Ad-BMP7滴度1×109pfu/ml。山羊抗TFAM单克隆抗体(SantaCruz公司)，TRIzol试剂盒(Gibco公司)，逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒为公司产品，RT-PCR引物由百替生物技术有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 收集样本和建立软骨细胞的体外培养体系 无菌条件下取膝骨关节炎关节置换术中取下关节软骨后立即置入盛有含青霉素钠/链霉素双抗液的PBS无菌培养皿中，无菌生物柜取材术中切除的关节全层软骨片(去除周围附着的软组织)，无菌手术刀片切块、剪碎，加入PBS液冲洗，将软骨移入离心管中，加入Ⅱ型胶原酶，37℃培养箱中消化，其中2 h后每隔20 min晃动1次离心管，至悬液变混浊确定为软骨块基本被消化。之后离心，弃上清液。加入完全培养基，充分吹打混匀后可获得含有软骨细胞的悬液。

1.2.2 Ad-TFAM骨关节炎软骨细胞 选取0.5×105个/ml的对数生长期传代骨关节炎患者的软骨细胞悬液接种于24孔培养板中，置于细胞培养恒温箱中培养过夜。24 h后并立即用事先预热到 37℃的新鲜空白培养基 LV-EGFP按感染复数即MOI=1、10、50、100、500、1 000、104，AV-EGFP 按相应的 MOI值稀释病毒，同时设立空白对照组(MOI=0)。将稀释好的不同浓度病毒液加入细胞中，放回恒温培养箱。达到规定时间后，吸去含病毒的培养液，换上新鲜的完全培养液，继续在恒温培养箱培养。以后每2～3 d换液1次。

1.2.3 RT-PCR检测细胞中TFAM mRNA的表达水平 取转染腺病毒72 h后的MOI值为500、1 000的两组骨关节炎患者软骨细胞和空白对照组，采用TRIzol法抽提总RNA，将 RNA反转录成 cDNA。取1 μl作为模板进行 RT-PCR反应。TFAM上游引物5'-GGAATGTGGAGCGTGCTAAAA-3'，下游引物 5'-TGCTGGAAAAACACTTCGGAATA-3'，片段长度 118 bp。β-actin上游引物 5'-TTCGAGCAAGAGATGGCCA-3'，下游引物 5'-TACATGGTGGTGCCGCC-3'，片段长度270 bp。RT-PCR反应条件:95℃预变性 5 min;95℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃延伸 1 min(30个循环);72℃终延伸10 min。

1.2.4 Western印迹检测细胞中TFAM蛋白的表达水平 取转染腺病毒72 h后的MOI值为500、1 000的两组骨关节炎患者软骨细胞和空白对照组，每个孔加入细胞裂解液，充分作用后放置冰上;用小刮匙将裂解物刮下，收集入EP管中，－80℃冻存。采用Western印迹检测TFAM蛋白的变化，SDS-PAGE凝胶电泳，转膜与封闭，一抗及二抗孵育。在凝胶成像仪上扫描条带，以其和内参β-actin、GAPDH吸光度值的比值来反映其相对含量。

1.2.5 实时荧光定量PCR检测线粒体DNA拷贝数 细胞线粒体DNA的提取:加RNase(200 μg/ml)于37℃消化RNA。之后用酚、酚/氯仿、异戊醇(体积比为25∶24∶1)DNA以去除蛋白质、脂类等其他物质。纯化后的线粒体DNA量较少，线粒体DNA溶液加入0.6倍体积异丙醇或沉淀缓冲液，置于－20℃下放置30 min，进行离心即得纯净的线粒体DNA。

线粒体DNA拷贝数的实时荧光定量PCR检测:以线粒体DNA HV1和核单拷贝基因β-globin分别作为线粒体和核DNA拷贝数的标记。设计HV1和β-globin基因的引物及探针，对该基因片段进行PCR扩增，在绘制标准曲线的基础之上，分别对待测样本线粒体HV1和β-globin基因进行实时荧光定量PCR检测。线粒体DNA的拷贝数计算公式:相对拷贝数/二倍体核基因组 =2 ×HV1/β-globin。

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0软件进行方差分析。计数资料用χ2分析，计量资料以±s表示。

2 结果

2.1 Ad-TFAM对骨关节炎软骨细胞转染效率鉴定 Ad-TFAM骨关节炎软骨细胞后，经免疫荧光染色，呈现绿色荧光为阳性细胞，未感染的细胞无着色现象。随着MOI的增加，染色阳性率亦增加，当MOI=1 000时关节炎软骨细胞荧光着色阳性率达96%(见图1)，说明本方法构建重组腺病毒体外转染率高，目的基因能有效地得以表达。

图1 TFAM重组腺病毒对骨关节炎软骨细胞的转染率

2.2 RT-PCR检测细胞中TFAM mRNA的表达水平 总RNA样本纯度高，且所取组织RNA无降解，28 s rRNA、18 s rRNA条带清晰，5 s rRNA条带不明显(图2)，置于紫外分光光度计上波长为260 nm和280 nm处测量吸光值，两者比值均在1.7～2.0。RT-PCR结果显示细胞转染TFAM重组腺病毒后MOI为500、1 000组TFAM mRNA的表达明显升高(P＜0.01)，说明转染Ad-TFAM后的软骨细胞中有TFAM目的基因mRNA水平的表达，见图3。

图2 总RNA提取

图3 骨关节炎软骨细胞转染后TFAM mRNA的表达水平

2.3 Western印迹检测细胞中TFAM蛋白的表达水平 Western印迹结果表明骨关节炎软骨细胞转染TFAM重组腺病毒72 h后MOI为500、1 000两组，TFAM蛋白表达均升高，其中MOI=1 000组表现最为明显(P＜0.01)，见图4。

图4 骨关节炎软骨细胞转染后TFAM蛋白的表达水平

2.4 线粒体DNA拷贝数变化 根据不同浓度的标准品测得的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数 (Ct)值绘制标准曲线，呈直线相关。HV1和β-globin基因定量PCR标准曲线的相关系数分别为0.996和0.998，斜率分别为－3.148和－3.369。骨关节炎细胞组线粒体DNA的平均拷贝数为(389±117)，而MOI=500组为 (575±144)，MOI=1 000组为 (762±179)，前者显著低于后两者 (P＜0.01)。

3 讨论

软骨细胞的凋亡与线粒体有密切的关系〔3〕。Musumeci等〔4〕研究认为，线粒体的功能障碍是破坏了软骨细胞在关节内微环境，从而导致了骨关节炎的发生。Blanco等〔5〕认为在骨关节炎的软骨细胞线粒体功能障碍可能来自体细胞中的线粒体DNA突变或炎症介质的直接影响，导致其合成和生长的缺陷，最终使软骨基质钙化和软骨细胞凋亡的增加。线粒体的复制和转录过程需要核编码的一些转录因子进行调控。在哺乳动物中已经鉴定出两种转录因子:TFAM和TFBM〔6〕。在哺乳动物线粒体的功能活动中起主要调节作用的因子是TFAM〔7〕。

Kim等〔8〕研究认为保持线粒体DNA的完整性是必要的，这样可以防止软骨细胞中IL-1β和TNF-α诱导细胞凋亡。吕红斌等〔9〕发现骨关节炎的发病与关节软骨中软骨细胞线粒体DNA的突变关系密切。TFAM具有调节线粒体DNA的拷贝数的功能，Rebelo等〔10〕研究认为TFAM与线粒体DNA在线粒体中结合成复合体，从而保持线粒体DNA结构的稳定性，Ekstrand等〔11〕认为在小鼠中过表达人类的TFAM会导致线粒体DNA拷贝数的增加，但不会增加线粒体呼吸链的含量或者线粒体的总量;TFAM还可维护线粒体DNA的完整和稳定，林恒等〔12〕探讨发现阻断目的基因TFAM的表达使得rhALR对梗阻性黄疸大鼠肝功能的保护作用消失;TFAM促进线粒体DNA的损伤修复，Nakanishi等〔13〕研究后认为TFAM可以改善线粒体DNA的损伤和减少，由此产生的氧化还原调节炎症反应;Woo等〔14〕研究了敲除线粒体TFAM基因的小鼠，发现其线粒体DNA出现缺失，同时出现线粒体的氧化损伤。本研究结果提示转染AdTFAM可正向增强其在软骨细胞中的表达，保持线粒体DNA结构的稳定性，TFAM在保护软骨细胞退变过程中起重要作用，从而促进关节软骨缺损的修复。

综上所述，AdTFAM载体转染骨关节炎软骨细胞，证实TFAM保护软骨细胞退变的作用。为利用TFAM在逆转软骨细胞凋亡、最终治疗骨关节炎提供理论和实验依据。这将可以对骨关节炎的病因提出新的解释，为骨关节炎的治疗提供新的途径，对社会产生巨大影响。

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