棓丙酯对糖尿病肾病肾小球内皮细胞增殖抑制的机制

田少江 干艳捷 刘辉辉 王黎萍 沈建明 李骏峰

(湖北医药学院附属人民医院肾内科，湖北 十堰 442000)

早期糖尿病肾病(DN)最突出的病理改变是肾小球肥大。最近研究发现，DN早期肾小球内存在广泛的新生血管形成，这些新生血管可能是肾小球肥大的结构基础〔1〕。由于我们的早期研究发现，与活血化瘀类中药赤芍提取物类似的棓丙酯可减轻DN患者蛋白尿、减轻早期DN肾小球肥大，对DN发挥保护作用〔2，3〕，本研究应用DN大鼠模型，探讨棓丙酯对DN肾小球内皮增殖和新生血管形成的干预效果，探索棓丙酯保护DN的机制。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂 清洁级雄性SD大鼠购自华中科技大学实验动物中心;兔抗大鼠血管内皮生长因子-A(VEGF-A)、小鼠抗大鼠CD31抗体及相应的羊抗兔和羊抗小鼠荧光标记和酶标记二抗均购自武汉博士德生物工程有限公司;大鼠磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、VEGF-A引物和Marker由大连TaKaRa公司合成;链脲佐菌素和棓丙酯均购自Sigma公司;大鼠白蛋白尿试剂盒购自上海瑞齐生物科技公司;尿肌酐检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 动物模型的制备和处理 对16只SD大鼠应用链脲佐菌素(60 mg/kg)一次性腹腔注射建立糖尿病模型(3 d后空腹血糖≥16.7 mmol/L者，确定为DM模型成功)，另用7只作正常对照组。造模成功的大鼠随机分为两组，一组为模型组，另一组为治疗组。治疗组大鼠给予棓丙酯(2 mg/kg)腹腔注射治疗(6次/w)。于模型成功后8 w代谢笼收集24 h尿液，用试剂盒检测尿白蛋白和尿肌酐。尿液收集完成后杀鼠取肾，取肾前用生理盐水充分灌洗肾脏。将获得的肾组织分为2部分:一部分立即作4%多聚甲醛固定;另部分－80℃保存，分离肾小球。

1.3 PAS染色 取多聚甲醛固定标本制作常规石蜡切片，PAS染色后评价肾小球肥大，系膜基质增生程度。显微镜下观察，根据肾小球肥大和血管襻增加程度进行损伤评分。

1.4 免疫荧光染色 PBS浸洗冰冻切片OTC三次，用柠檬酸液进行抗原热修复后入PBS，无关血清封闭30 min，滴加小鼠抗大鼠 CD31抗体，4℃过夜，37℃复温30 mim，PBS浸洗3次，滴加荧光素标记的羊抗小鼠二抗，37℃孵育2 h，PBS浸洗后加甘油PBS封片，荧光显微镜下观察并照相，输入电脑后以荧光面积值表示荧光强度。

1.5 RT-PCR检测 筛网提取各组肾组织的肾小球，各取100 mg小球组织加入Trizol 1 ml提取总RNA，参照说明书进行RT-PCR检测。其所用引物分别为:GAPDH，上游引物5'-ACC ATG GAG AAG GCT-3'，下游引物5'-AGT GTA GCC CAG GAT-3'产物大小522 bp。VEGF-A上游引物5'-TGC ACC CAC GAC AGA AGG GGA-3'，下游引物:5'-TCA CCG CCT TGG CTT GTC ACA-3'产物片段大小429 bp。

1.6 Western印迹 取0.1 g肾小球组织加5倍体积的细胞裂解液，提取组织总蛋白。取100 μg总蛋白行SDS-PAGE电泳后，将胶板取下，转移缓冲液洗涤10 min，在60 mA的电流下将蛋白转印到硝酸纤维素膜上，经Tris盐酸缓冲液冲洗2遍，5%脱脂奶粉溶液室温封闭，4℃过夜。将膜与兔抗鼠VEGF-A、β-actin抗体(1∶400)4℃孵育过夜，TBST洗脱3次，再与二抗(HRP标记的羊抗兔IgG抗体，稀释度为1∶2 000)室温孵育1 h，TBST溶液洗脱3次，与ECL化学发光剂作用后胶片显影，扫描电泳条带，用Band leader软件分析电泳条带光密度。

1.7 统计学方法采用SPSS11.5软件。各组数据均以±s表示，各组间计量资料应用方差分析进行统计，相关分析采用Spearman相关分析。

2 结果

2.1 肾小球病理变化 肾组织PAS染色显示模型组大鼠较正常对照组肾小球普遍肥大，毛细血管襻增多增粗，系膜基质增加较明显，而治疗组较模型组肾小球肥大有所减轻，毛细血管襻减少，系膜基质也有所减少。见图1。

图1 三组大鼠肾小球病理变化(PAS染色，×400)

2.2 肾小球内皮细胞增殖状态 以内皮标志分子CD31所进行的血管内皮细胞标记显示，糖尿病肾病组内皮细胞及新生内皮细胞较正常对照组明显增多，而棓丙酯治疗组内皮细胞及新生血管较模型组显著减少。见图2。

图2 三组大?鼠肾小球血管增殖状态

2.3 尿白蛋白排泄率变化 各组动物的尿白蛋白水平经尿肌酐标化后表示为:正常对照组(155.3±37.8)μg/mg creatinine;模型组(483.7±87.4)μg/mg creatinine;治疗组(261.9±23.5)μg/mg creatinine。模型组较正常对照组显著升高(P＜0.01)，而治疗组又较模型组显著下降(P＜0.01);模型组中各动物的尿白蛋白水平与CD31的荧光强度成正相关(r=0.62，P ＜0.01)。

2.4 肾小球VEGF的表达 在mRNA水平上，模型组肾小球VEGF-A表达明显升高，但在治疗组这种升高受到显著抑制;在蛋白水平上，模型组肾小球VEGF-A表达也明显升高，但在治疗组这种升高也受到显著抑制。见图3。

图3 VEGF-A mRNA及蛋白在各组动物肾小球中的表达

3 讨论

DN是目前最常见的继发性肾小球损害性疾病，由于其进展快、并发症多，是目前导致慢性肾衰竭的主要原因，尤其是在老年透析患者中，由DN导致的肾衰竭远远超过其他病因。自血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)和转化酶受体拮抗剂(ARB)类药物应用以来，针对DN的治疗虽取得了一定的疗效，但总体上看，现今对DN的防治措施仍十分缺乏。本研究和我们前期的研究均发现，与活血化瘀类中药提取物结构相同的棓丙酯可在一定程度上减轻DN患者的蛋白尿，抑制DN大鼠的肾小球肥大，提示棓丙酯可能通过减轻肾小球内毛细血管损害而对DN发挥保护作用〔2，3〕，本研究进一步探讨了棓丙酯对早期DN的保护作用机制，结果表明棓丙酯可明显减轻肾小球内皮增殖和新生血管程度，显著降低肾小球内VEGF的表达水平。

VEGF是最强的引起内皮细胞活化增殖的因子之一，DN状态下肾小球内足细胞表达的VEGF增加是促进内皮活化增殖的主要动力〔4〕。研究表明，下调肾小球内VEGF表达，或阻滞VEGF受体可抑制DN的进展〔5，6〕。在本研究中，不论是在mRNA水平还是在蛋白水平上，棓丙酯都可以下调VEGF的表达，这种下调作用可能就是导致本研究结果所观察到的肾小球新生血管显著减少的原因。内皮增殖和新生血管的减少可能从结构上防止了糖尿病微血管病变对肾小球滤过膜的损害，可能是促成本研究所见的白蛋白尿水平下降的原因。白蛋白尿既是DN时肾小球损害程度指标，也作为一种DN预后判断指标〔7〕，白蛋白尿的减低必然使棓丙酯对DN的保护作用更加明确。

事实上，棓丙酯可能不仅仅是从抑制VEGF表达的角度抑制DN的进展，研究表明，棓丙酯可能还通过恢复肾小球内eNOS活性，提高肾小球组织内一氧化氮水平，阻碍内皮细胞活化增殖而对DN发挥保护作用〔3〕。从目前的研究结果判断，棓丙酯可能通过多个途径维护早期DN肾小球结构和功能的完整，其他效应有待进一步探讨。

1 Nakagawa T，Kosugi T，Haneda M，et al.Abnormal angiogenesis in diabetic nephropathy〔J〕.Diabetes，2009;58(7):1471-8.

2 Tian S，Gan Y，Li J，et al.Imbalance of glomerular VEGF-NO axis in diabetic rats:prevention by chronic therapy with propyl gallate〔J〕.J Nephrol，2011;24(4):499-506.

3 田少江，王黎萍，沈建明，等.棓丙酯对糖尿病肾病大鼠肾小球血管内皮生长因子——一氧化氮轴的维护作用〔J〕.中国现代医学杂志，2010;20(22):3400-3.

4 Nakagawa T.Uncoupling of the VEGF-endothelial nitric oxide axis in diabetic nephropathy:an explanation for the paradoxical effects of VEGF in renal disease〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol，2007;292(6):F1665-72.

5 Nasu T，Maeshima Y，Kinomura M，et al.Vasohibin-1，a negative feedback regulator of angiogenesis，ameliorates renal alterations in a mouse model of diabetic nephropathy〔J〕.Diabetes，2009;58(10):2365-75.

6 Tesch GH，Lim AK.Recent insights into diabetic renal injury from the db/db mouse model of type 2 diabetic nephropathy〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol，2011;300(2):301-10.

7 de Zeeuw D，Remuzzi G，Parving HH，et al.Proteinuria，a target for renoprotection in patients with type 2 diabetic nephropathy:lessons from renal〔J〕.Kidney Int，2004;65(6):2309-20.