三七总皂苷对HB-EGF诱导的系膜细胞增殖作用研究

黄美春 胡 刚 朱芸芸 丁慧登 鲁 盈 浙江省立同德医院肾内科 杭州 310012

三七总皂苷对HB-EGF诱导的系膜细胞增殖作用研究

黄美春 胡 刚 朱芸芸 丁慧登 鲁 盈 浙江省立同德医院肾内科 杭州 310012

目的：观察三七总皂苷对肝素结合性表皮生长因子样生长因子（HB-EGF）诱导大鼠肾小球系膜细胞增殖的作用。方法：以原代培养大鼠肾小球系膜细胞为细胞模型，以400ng/mL三七总皂苷和100ng/mL HB-EGF为干预因素，实验分对照组、100ng/mL HB-EGF组和400ng/mL三七总皂苷+100ng/mL HB-EGF组，刺激系膜细胞24、36、48h，采用MTT方法，观察三七总皂苷对重组HB-EGF诱导系膜细胞增殖的作用情况。结果：HB-EGF刺激36h时，系膜细胞明显增殖，与对照组比较，P＜0.05；三七总皂苷能抑制HB-EGF诱导的系膜细胞的增殖，与HB-EGF组比较，P＜0.05。随着刺激时间的延长，三七总皂苷对HB-EGF诱导系膜细胞增殖的抑制作用增强，但36h与24h比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与48h比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：三七总皂苷能抑制HB-EGF诱导的系膜细胞增殖作用，且作用随着刺激时间延长而增强。三七总皂苷可能通过抑制HB-EGF对系膜细胞增殖作用而延缓肾小球硬化。

HB-EGF 系膜细胞 细胞增殖 三七总皂苷

三七属活血化瘀药物，中医临床常用于多种肾脏病的治疗，并取得了一定疗效。三七总皂苷是三七最主要的生物活性成分，具有抑制系膜细胞增生、细胞凋亡、细胞因子分泌等多种作用[1]。肝素结合性表皮生长因子样生长因子（heparin-binding epidermal growth factor like growth factor，HB-EGF）是近年来新发现的、国内外研究热门的肽类生长因子，研究表明其在多种肾脏病变中起重要作用，尤其在缺血损伤肾脏病变，致肾脏病变进展[2]。本研究观察三七总皂苷对HB-EGF诱导肾小球系膜细胞增殖的作用，以进一步认识三七总皂苷治疗肾脏病的作用机制，及其临床应用前景。

1 实验材料

1.1 动 物 健康SD大鼠2只，体质量150～200g，由浙江中医药大学动物实验中心提供，动物合格证号：SCXK（沪 2003-003），饲养于清洁环境、温度 20～22℃，相对湿度40%～60%。

1.2 药物及试剂 三七总皂苷（云南植物药厂）；HB-EGF（R＆D systems）；RPMI-1640 培养基（Gibco BRL公司)；胎牛血清（FCS，杭州四季青生物技术公司）；ô型胶原酶（Sigma公司）；胰蛋白酶（华美生物科技公司）；MTT试剂盒（凯基生物科技发展公司）。

2 实验方法

2.1 肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cell，GMC）的原代培养及鉴定 系膜细胞原代培养和鉴定方法参见文献[3]。正常SD雄性大鼠2只，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，清洁取肾，去髓质，剁碎皮质，经120、80、200目筛网碾磨、过滤，在200目上收集肾小球，5mg/mL的Ⅳ胶原酶消化10min，洗涤后接种于含20%FCS的RPMI1640培养基的塑料培养瓶中，5%CO2、37℃培养箱孵育，当GMC长至80%融合时用0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化传代。系膜细胞按常规方法进行电镜、免疫组化方法鉴定。取3～6代细胞用于实验。

2.2 三七总皂苷对HB-EGF诱导系膜细胞增殖的作用 应用MTT法测定细胞增殖。实验分对照组、100ng/mL HB-EGF组和 400ng/mL三七总皂苷+100ng/mL HB-EGF组，每组设4个复孔。取系膜细胞，以 1×104/孔接种于 96 孔培养板，每孔 200μL，培养48h后，换用无FCS的培养基培养24h，细胞同步化后去上清，分别加入所需浓度的2%FCS培养基200μL，刺激培养36h；同时按上述方法，三七总皂苷+100ng/mL HB-EGF 组刺激培养 24h、36h、48h。在结束前4h每孔加5mg/mL MTT 20μL，于CO2培养箱继续孵育4h，小心吸取上清，每孔加DMSO 200μL，震荡10min后，490nm波长测吸光度。

3 实验结果

3.1 三七总皂苷对HB-EGF诱导系膜细胞增殖的作用 在刺激系膜细胞36h时，HB-EGF能刺激系膜细胞增殖，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；三七总皂苷能抑制HB-EGF诱导的系膜细胞增殖作用，与HB-EGF组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表 1。

表1 三七总皂苷对HB-EGF诱导系膜细胞增殖的作用（±s）

表1 三七总皂苷对HB-EGF诱导系膜细胞增殖的作用（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与 100ng/mLHB-EGF 组比较，△P＜0.05

组 别对照组100ng/mLHB-EGF 组三七总皂苷+100ng/mLHB-EGF组n/孔P值444 OD值0.4109±0.0074 0.5503±0.0061*0.4210±0.0066△0.062 0.000 0.000

3.2 不同刺激时间三七总皂苷对HB-EGF诱导系膜细胞增殖的作用 随着刺激时间的延长，三七总皂苷对HB-EGF诱导系膜细胞增殖的抑制作用增强，但36h与24h比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；48h与36h比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 2。

表2 不同时间三七总皂苷对HB-EGF诱导系膜细胞增殖的抑制作用（±s）

表2 不同时间三七总皂苷对HB-EGF诱导系膜细胞增殖的抑制作用（±s）

注:与 36h 比较，▲P＜0.05

时间24h 36h 48h n/孔p 444 OD值0.4247±0.0095 0.4210±0.0066 0.4031±0.0096▲0.560 0.015

4 讨论

HB-EGF是1991年Higshiyame等首先发现的一种肽类生长因子，属于表皮生长因子家族，在体内广泛分布，与胞膜上EGF受体紧密结合，通过PKC和Ca2+信号途径发挥作用，参与多种病理生理过程，认为与伤口愈合、缺血再灌注损伤、先兆子痫、哮喘、冠状动脉病变等多种疾病密切相关，故成为近年来国内外研究热点[4-5]。HB-EGF 在肾脏方面的研究也越来越受关注。研究发现，HB-EGF与多种肾小球疾病﹙尤其在缺血再灌注肾损害、系膜增生性肾炎等﹚密切相关，笔者研究发现HB-EGF能促进系膜细胞增生和TGF-β的分泌和表达[6]。进一步研究发现HBEGF/EGFR通路在肾小球疾病（尤其急进性肾小球肾炎）起关键作用，认为是肾小球疾病的一个新的治疗靶点，打开了EGFR阻滞剂的临床应用前景[7-8]。故探讨中医药在HB-EGF/EGFR通路的作用具有重要临床意义。

三七具有活血化瘀作用，临床治疗慢性肾小球肾炎等多种肾脏病取得良好疗效，延缓了慢性肾脏病的进展。研究表明，三七的生物活性成分三七总皂苷能抑制系膜细胞增殖，通过抗氧化应激抑制诱导足细胞凋亡，抑制多种细胞因子分泌等作用，在抗肾小球硬化和肾间质纤维化治疗中具有良好疗效[9]。研究证实，在肾外血管内皮细胞损伤修复中起重要作用，对肺血管内皮细胞有损伤修复作用，能改善人脐静脉内皮细胞分泌功能，减轻缺氧再给氧损伤[10]。所以，设想三七总皂苷可能对肾脏病变中HB-EGF/EGFR通路起作用，故本课题就三七总皂苷对HBEGF诱导的系膜细胞增殖作用方面做进一步研究，开拓三七总皂苷在肾脏病的应用前景。

本研究发现，在刺激36h时HB-EGF能刺激系膜细胞增殖（与对照组比较，P＜0.05）；三七总皂苷能抑制HB-EGF诱导的系膜细胞增殖作用（与HBEGF组比较，P＜0.05）。在不同刺激时间，随着刺激时间的延长，三七总皂苷对HB-EGF诱导系膜细胞增殖的抑制作用增强，但36h与24h比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与 48h比较，有显著性差异（P＜0.05）。说明三七总皂苷能抑制HB-EGF诱导的系膜细胞增殖作用，且随着刺激时间延长，抑制作用增强。故推测三七总皂苷可能通过抑制HB-EGF途径在肾脏病治疗中起重要作用。

［1］祝正明，孙建实，赵湘.三七总皂苷对大鼠肾小球系膜细胞CTGF表达及细胞外基质产生的影响［J］.中华中医药学刊，2009，27（4）：853-855.

［2］Uttarwar L，Peng F，Wu D，et al.HB-EGF release mediates glucose-induced activation of the epidermal growth factor receptor in mesangial cells［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2011，300（5）：921-931.

［3］谌贻璞，高进，刑宝才，等.肾小球系膜细胞培养［J］.北京医科大学学报，1989，21（4）：335-336.

［4］Higashiyama S，Abraham JA，Miller J，et al.A heparin-binding growth factor secreted by macrophage-like cells that is related to EGF［J］.Science，1991，251：936-939.

［5］Pal Gooz1，Yujing Dang1，Shigeki Higashiyama，et al.A Disintegrin and Metalloenzyme（ADAM）17 Activation Is Regulated by a5b1 Integrin in Kidney Mesangial Cells［J］.PLoS ONE，2012，7（3）：1-9.

［6］Luo CC，Ming YC，Chao HC，et al.Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor downregulates expression of activator protein-1 transcription factor after intestinal ischemia-reperfusion injury［J］.Neonatology，2011，99（4）：241-246.

［7］Raed N，Bou Matar，Janet D.Klein,etal.Erlotinib Preserves Renal Function and Prevents Salt Retention in Doxorubicin Treated Nephrotic Rats［J］.PLoS One，2013，8（1）：54738-54746.

［8］Bollée G，Flamant M，Schordan S，et al.Epidermal growth factor receptor promotes glomerular injury and renal failure in rapidly progressive crescentic glomerulonephritis［J］.Nat Med，2011，17（10）：1242-50.

［9］孙文，冯丽园，赵宗江，等.三七总皂苷干预糖尿病肾病大鼠氧化应激及足细胞凋亡机制的实验研究［J］.中华中医药杂志，2011，26（5）：1062-1067.

［10］江小萍，李海全，潘少霞，等.三七总皂苷对缺氧再给氧血管内皮细胞钙离子浓度及肌浆网Ca2+-ATP酶活性的影响［J］.中华中医药学刊，2011，29（4）：758-761.

Effect of Panax Notoginseng Saponins on proliferation of mesangial cell induced by HB-EGF

HUANG Meichun，HU Gang，ZHU Yunyun，et al.Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310012),China

Objective：To investigate the influence of panax notoginseng saponins（PNS） on proliferation of mesangial cell induced by heparin-binding epidermal growth factor like growth factor（HB-EGF） and its mechanism in kidney disease.Methods：The primary cultured SD rat mesangial cell were used as cell models.The cells were divided into control group，100 ng/ml HB-EGF group，and 400 ng/ml PNS+100 ng/ml HB-EGF group，and were cultured with these solutions for 24，36，and 48 h，respectively.Cell proliferation was assessed by MTT colorimetric assay.ResultsHB-EGF stimulated the proliferation of mesangial cells in 36 h（compared with control group P＜0.05）but the effect was inhibited by PNS（compared with HB-EGG group P＜0.05），and the effect of inhibition in 48 h was more obvious than that in 36 h（P＜0.05）.But no significant difference in the effect of inhibition was noted between cells treated for 36 h and 24 h（P＞0.05).ConclusionPNS can inhibit the proliferation of mesangial cells induced by HB-EGF，and the effect of inhibition gradually increases with the prolongation of the culture time.PNS may retard the development of glomerular sclerosis by inhibiting the proliferation of mesangial cells induced by HB-EGF.

HB-EGF mesangial cells cell proliferation panax notoginseng saponins

2013-06-05