乳康汤含药血清对大鼠乳腺增生组织ER和PR表达及细胞凋亡的实验研究

叶志雄，陈泳晖，肖柳英

(1.广州市番禺疗养院，广东 广州市 511490;2.广州市番禺区中医院，广东 广州 511400;3.广州市中医医院,中医中药研究所，广东 广州510130)

乳腺增生病是女性最常见的乳房疾病，其发病率占乳腺疾病的首位[1]。近年来该病发病率呈逐年上升的趋势，年龄也越来越低龄化，据调查约有70%～80%女性都有不同程度的乳腺增生，多见于25～55 岁的女性，其病因目前多认为与内分泌激素失调有关，本病有一定的癌变危险所以对本病进行积极的治疗有着重大的意义。乳康汤是由党参、桂枝、青皮、三棱、茯苓等12 味纯中药制成的以活血行软坚、散结通络、止痛为基本治法的复方制剂，经临床应用具有减轻疼痛、缩小软化肿块疗效。中医药治疗本病有着独特的优势和潜力，能从整体出发调节内分泌、增强机体免疫力。本研究采用苯甲酸雌二醇和黄体酮复制大鼠乳腺增生病模型，观察不同剂量乳康汤对模型大鼠乳腺增生的治疗作用和对组织细胞ER和PR表达及细胞凋亡的变化情况，探讨乳康汤治疗乳腺增生可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级SD 大鼠60 只，体重150～180g，雌性，未孕，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号：SCXK (粤)2008-0002；饲养条件：SPF 级动物实验室，室温23～25℃，相对湿度40～70%，每小时换新风15 次，广东省实验动物许可证号为SYXK (粤)2008-0021。饮水：纯化水罐装聚乙烯朔料瓶，供动物自由饮用，每天换水一次。饲料：由广东省医学实验动物中心提供。

1.2 药物和试剂

乳康汤的制备：取党参、桂枝、茯苓、青皮、三棱、海藻、柴胡、川芎、莪术、乳香、皂角刺、郁金12味中药材经检测合格后，按制剂工艺标准要求制成浓缩液，置4℃冰箱保存，由广州市中医中药研究所制备。苯甲酸雌二醇注射液：天津金耀氨基酸有限公司生产(批号：H20080625)；黄体酮注射液：由天津金耀氨基酸有限公司生产(批号：H20080625)；乳结平胶囊：广东彼迪药业有限公司生产 (批号：H44026123)；DAB 显色试剂盒(批号：AR1022)、ER试剂盒(批号：BA0345)、PR 试剂盒(批号：BA0107)，均购于武汉博士德生物工程有限公司；SABC 免疫组化染色试剂盒(批号：SA1026)，由南京建成生物工程研究所提供；其余试剂均为国产分析纯。

1.3 主要仪器

电子天平：沈阳龙腾电子称量仪器有限公司；FACS-440 型流式细胞仪(美国Bectondickinson 公司)；XH-6010γ 放射免疫计数器；CX41-32RFL 型荧光显微镜(日本Olympus 公司)；Eppendorf 低温高速冷冻离心机(德国)；BIO-RAD-450 型酶标定量测试仪(美国)NIKON EC30 型倒置光学显微镜：日本NIKON 公司；BECMA 全自动生化分析：美国BECMAN 公司；

1.4 动物分组及造模

SD 未孕雌性大鼠60 只，饲养于干燥、通风、安静的环境中，适应性喂养1 周后，按大鼠体重随机分为空白对照组、模型对照组、乳结平阳性组(3.3g·kg-1·d)、高剂量乳康汤组(25 g/kg/d)、中剂量乳康汤组(12.5 g/kg/d)，低剂量乳康汤组(6.25 g/kg/d)共6组，每组10 只。按照参考文献(2)方法，空白对照组大鼠给予肌肉注射0.9%氯化钠注射液(1mL/kg/d)，模型组各组按体重于大鼠后肢后外侧肌肉注射苯甲酸雌二醇0.5mg/kg/d，每天1 次，连续25天，后改用黄体酮4mg/kg/d，每天1 次，连续5天。于第31天开始，空白组和模型组大鼠灌胃给予蒸馏水，乳结平组和乳康汤3 个剂量组分别灌胃给予相应剂量的药物，连续给药30天。

1.5 观测指标

实验开始后,观察各组动物的状况，动物进食、饮水和体重改变。每周用游标卡尺测量大鼠左侧腋窝下第3 对乳头的直径、高度，肉眼观察形态学的变化。取乳房用10%甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色后光镜下进行组织学观察，检测导管上皮细胞层数、腺泡数；取子宫称重，计算子宫指数，子宫指数=子宫重量(g)/体重(100g)；末次给药24h 后，腹主动脉取血，离心(3500r/min,5min),取血清,2～8℃条件下保存，放射免疫法(RIA)测量血清雌二醇、泌乳素和孕酮水平；免疫组化法检测大鼠乳腺组织ER和PR表达情况；用流式细胞仪上检测，经计算机系统Cellquest 软件分析，绘制细胞数-DNA 分布图，计算凋亡细胞所占比例。具体操作按说明书进行。

1.6 数据处理

实验数据用均数±标准差表示，采用SPSS13.0统计软件进行处理,用重复测量方差分析和单向方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳康汤对乳腺增生大鼠乳头形态影响

结果表明，大鼠经注射雌激素和黄体酮处理4周后，乳头出现红肿或增大，模型对照组大鼠乳头红肿或增大明显，乳结平和乳康汤各组在乳头直径、高度、形态学方面比较，乳头红肿或增生程度有所减轻(P＜0.01)，见表1～表3。

表1 乳康汤对各组乳腺增生模型大鼠乳头直径的比较

表2 乳康汤对各组乳腺增生模型大鼠乳头高度的比较

2.2 乳康汤对乳腺增生大鼠导管上皮层数、腺泡数的影响

实验结果表明：模型对照组与空白组比较，导管上皮细胞层数、腺泡数明显增多(P＜0.01)。乳康汤3 个剂量组与模型组比较，增生程度均低于模型组，导管上皮细胞层数、腺泡数明显减少，差异有统计学意义(P＜0.01)；而乳康汤3 个给药组之间导管上皮细胞层数、腺泡数差异无统计学意义(P＞0.05)。结果见表4。

表4 乳康汤对各组乳腺增生模型大鼠上皮细胞及腺泡数的影响

2.3 乳康汤对乳腺增生模型大鼠子宫指数的影响

结果表明：模型对照组子宫指数明显高于空白组(P＜0.01)；乳康汤高、中、低剂量组大鼠子宫指数明显低于模型组(P＜0.05)，结果见表5。

表5 乳康汤对各组乳腺增生模型大鼠子宫指数的影响

2.4 乳康汤对乳腺增生模型大鼠雌激素的影响

结果表明：模型对照组激素水平明显高于空白组(P＜0.01)，模型大鼠血清雌二醇(E2)和泌乳素(PRL)明显升高，孕酮(P)明显降低，乳结平和乳康汤各给药组均能显著降低模型大鼠血清雌二醇(E2)、泌乳素(PRL)而升高孕酮(P)的含量，与模型对照组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05-0.01)，结果见表6。

表6 乳康汤对各组乳腺增生模型大鼠雌激素的影响

2.5 乳康汤对乳腺增生模型大鼠乳腺组织ER和PR表达的影响

结果表明：模型对照组ER和PR 水平明显高于空白组(P＜0.01)，乳结平和乳康汤3 个剂量组给药后均可使乳腺组织ER和PR表达降低，但乳康汤高、中2 个剂量组降低较为显著(P＜0.01)，见表7；

表7 乳康汤对各组乳腺增生模型大鼠乳腺组织ER和PR表达的影响

2.6 乳康汤对乳腺增生鼠乳腺组织细胞凋亡或死亡的影响

结果表明：空白组和模型对照组大鼠乳腺组织细胞出现的凋亡细胞较少；高、中剂量乳康汤组大鼠乳腺组织细胞出现较高的凋亡细胞或死亡细胞(P＜0.01,P＜0.05)，低剂量组的凋亡细胞或死亡细胞变化较小(P＞0.05)。见表8。

表8 乳康汤对各组乳腺增生鼠乳腺组织细胞凋亡或死亡的影响

3 讨论

乳腺增生病又称乳腺结构不良,属中医乳癖的范畴，是育龄妇女最常见的一种乳房疾病，可发生于青春期开始以后的任何年龄妇女，尤以20～45 岁的女性居多，其发病率占全部乳房疾病的74.1%，占育龄妇女的40%，且有逐年上升的趋势，目前该病已被列为乳腺癌的高危因素。治疗乳腺增生病的关键就是调整体内垂体-性腺的激素分泌活动，调整体内激素紊乱水平[3-4]。西医认为，周期性的性激素分泌失调与乳腺组织对激素的敏感性增高是乳腺增生的主要发病机制[5]。一方面，乳腺增生患者体内雌激素分泌增多，孕激素分泌不足；另一方面，患者体内泌乳素水平升高，泌乳素对乳腺组织有直接刺激作用，其还可抑制黄体期孕酮的分泌，刺激雌二醇的合成，从而导致雌孕激素比例失调，在雌激素持续刺激下，使乳腺组织增殖过度，导致乳腺增生[6]。在治疗方面多采用降低雌二醇、纠正激素分泌紊乱的方法。国外一直采用针对雌激素增高选用抑制雌激素类药物的治疗方案，使体内甾体激素大幅减低，竞争性与体内雌孕激素受体结合；此法虽具有一定的疗效,但副作用大,停药后容易复发且会加重机体内分泌的紊乱[7]。调节神经内分泌免疫网络，由于乳腺增生与内分泌激素失调密切相关[8]。而中医理论认为发生乳腺增生病是由于肝失疏泄，冲任失调而致气血运行不畅，气滞血瘀痰凝结聚而成。古人认为妇人之病，多起于郁，这是由妇女易为情志变化的心理中特点所决定的。国外文献报道，情绪的不稳定与女性乳房小叶增生有一定关系[9]。乳腺增生的治疗方法颇多,但迄今为止尚无疗效确切的方药。疏肝健脾方以疏肝健脾行气、活血化痰软坚为法,调理冲任,符合经脉有满有泄之规律,标本兼治,具有平衡内分泌激素水平的作用。朱萱萱等[10]桂枝茯苓胶囊对乳腺增生病相关激素水平的调整,桂枝茯苓胶囊由桂枝茯苓等药物组成，其主要功效是活血化瘀消癥，桂枝茯苓胶囊可以显著降低血中E2和P 水平，E2/P 比值升高，有调节雌激素孕激素比例失调的作用，但对泌乳素则未见明显影响。

本研究采用了目前公认的雌-孕激素联合的乳腺增生大鼠模型造模法，通过扰乱动物体内的性激素分泌,诱导动物的乳腺组织增生,最终复制模型成功,并考察了疏肝健脾法对大鼠乳腺增生的防治作用。以乳结平为阳性对照，以乳康汤的柴胡、青皮等疏肝理气，莪术活血化瘀,茯苓、健脾利湿，配伍应用达到疏肝活血、软坚散结、健脾化痰、调理冲任的治疗作用。实验表明：在一定时期内维持实验大鼠血中E2的高浓度，造成血中雌-孕激素比例失调，模型对照组的乳房和腺泡明显增大增多，导管上皮增生，其组织相与人类基本一致。且模型对照组与空白组比较E2 显著增加，孕酮显著减少，垂体泌乳素水平升高。说明在卵巢功能改变的同时，垂体功能也在发生改变，这与人类的病变相似。研究表明中医药治疗乳腺增生病的作用机理是调节神经内分泌免疫网络，使雌、孕激素达到平衡，增强机体免疫力。

研究结果显示：模型组大鼠在乳头形态、乳腺导管上皮细胞和腺泡、雌激素水平、子宫指数、ER和PR表达抑制和细胞凋亡等方面，与空白对照组相比，均有显著性差异，说明雌-孕激素联合成功复制出大鼠乳腺增生模型。3 个不同剂量乳康汤对乳腺增生模型大鼠干预后，乳头红肿或增生有所减轻，乳腺导管上皮细胞和腺泡异常增殖有一定的抑制，能显著降低模型大鼠血清雌二醇(E2)、泌乳素(PRL)而升高孕酮(P)的含量使乳腺组织对E的敏感性下降，减弱E 在靶细胞上的生物学效应，可使模型大鼠乳腺组织ER和PR表达显著降低，促进细胞凋亡，从而产生抑制和治疗乳腺增生的作用，有效提高机体自身的免疫功能。结果显示乳康汤对乳腺增生模型大鼠疗效与乳结平阳性对照组有相近效果。

综上所述，乳康汤以中医理论为指导，采用疏肝理气、活血化瘀散结诸法，通过改善增生动物血液中相关雌性激素的水平，对实验性乳腺增生大鼠具有明显的治疗作用。本研究进一步说明在疏肝活血治则指导下可用乳康汤治疗乳腺增生病，为临床用药提供科学的依据。

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