AGEs 对兔软骨细胞TNF-α和MMP-13表达的影响及其机制研究

陈 铖，马 翅，张 莹，肖 钧，蔡 巍，谭海涛

(湖南师范大学第二附属医院，解放军第163 医院，湖南 长沙 410003)

骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种随年龄增长而发病率明显增加的慢性关节疾病，主要表现为进行性关节破坏，其病因及发病机制复杂，包括年龄、肥胖、遗传、代谢和创伤等多种因素，其中年龄是OA 最突出的启动和进展的危险因素之一。有研究认为，随着年龄的增加体内大量晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)的产生和堆积是导致和加速年龄相关性OA 病变的重要原因之一[1-2]，其机制可能与AGEs 与蛋白质发生交联的直接作用及激活细胞内一系列信号转导通路而引发的间接作用有关，但具体途径目前还远未阐明。本研究旨在通过外源性AGEs 及相关抑制剂作用于兔软骨细胞后对OA的主要损伤因子TNF-α、MMP-13 及AGEs 细胞内信号通路可能存在的关键环节进行检测，以探明AGEs 对兔软骨细胞TNF-α和MMP-13表达的影响并初步探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

胰蛋白酶(美国Sigma 公司)；DMEM 培基(美国GIBCO 公司)；胎牛血清(FBS)(杭州四季青生物科研所)；牛血清白蛋白(BSA)(华美生物工程公司)；Trizol试剂(美国GIBCO 公司)；RT-PCR 试剂盒和引物(上海生工生物工程公司)；anti-RAGE(Sant Cruz 公司)；MDA,SOD，CAT 及ROS 检测试剂盒(碧云天生物技术公司)；II 型胶原酶(美国Sigma 公司)；PDTC(碧云天生物技术公司)。

1.2 外源性AGEs的制备

按Valencia JV的方法[3]制备AGEs。使用前，将制备的AGEs 置入pH 7.4的无菌PBS 透析液中透析48 h 以除去未结合的D-羟乙醛，再次用0.22 μm 针头滤器过滤。取制备的样品用LS-50B 型荧光分光光度计鉴定，在激发波370 nm，发射波440 nm 处释放荧光。以同样条件制备不含D-羟乙醛的BSA 作为AGEs的对照。

1.3 兔软骨细胞体外培养

取健康清洁级5 周龄雄性新西兰大白兔(体重约1.2～1.5 kg，购自湘雅动物实验中心)，麻醉后在无菌条件下迅速取膝关节和髋关节处软骨，用无菌PBS 冲洗后，将其剪成1-3mm3 碎块，将所制软骨碎块转移至25 mL 无菌培养瓶内，加入10 mL 0.2%的胰酶后置于37℃CO2 培养箱孵育45 min后弃去胰酶，加入10 mL 0.2% II 型胶原酶，置于37℃CO2 培养箱孵育90min 后收集消化液，1000 r/min 离心3 min 后将细胞重悬于含15%胎牛血清的DMEM 培养基中，37℃、5% CO2 培养箱中培养，所得即为原代兔软骨细胞，采用1～4 代的细胞进行实验。

1.4 干预与分组

在生长良好的1-4 代软骨细胞中加入不同浓度AGEs(0、1、10 、25 、50、100μg/mL)干预48 h 后检测相应指标，同时设立正常对照组(con组)。5 μg/mL Anti-RAGE 及0.1mmol/L NF-κB 抑制剂PDTC与软骨细胞预孵12 h 后，再加入作用最显著浓度AGEs 与软骨细胞共同孵育48h 后检测相应指标。

1.5 CAT、SOD 活性及MDA、ROS 水平检测

选择生长良好的1-4 代软骨细胞，按实验分组加入各处理因素继续孵育48h 后，按照MDA,SOD，CAT 及ROS 检测试剂盒使用说明书进行CAT、SOD 活性及MDA、ROS 水平检测。

1.6 TNF-α 及MMP-13 mRNA 测定

选择生长良好的1-4 代软骨细胞，按实验分组加入各处理因素继续孵育48 h 后采用Trizol 法提取总RNA。提取的RNA 采用分光光度法检测RNA 浓度。所有引物均由上海生工生物工程公司设计合成，TNF-α 上游引物为5'-GTGACGAGCCTCTAGCCCACGTAGT-3'，下游引物5'-GACCGCTGAAGAGAACCTGGGAGTA-3'，扩增产物为174bp；MMP-13 上游引物5'-CTTCTGGTCTTCTGGCTCACGCTTT-3'，下游引物5'-GGGTGTTTAGGGTTGGGGTCTTCAT-3'，扩增产物为292bp；GAPDH 上游引物 5' -TTCAACAGTGCCACCCACTCCTCTA-3，下游引物5'-TGGAAACTGTGAAGAGGGGCAGATT-3'，扩增产物为278 bp。PCR 条件为95℃预变性5min，95℃25s，68℃60 s，循环36 周，72℃延伸10 min。RT-PCR 结束后取5μL PCR 产物行1 %琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，将凝胶置于凝胶成像分析系统照相保存，用Imagemaster VDS 图像分析软件测定产物条带的积分光密度值。计算以GAPDH 为内对照，定量分析基因表达水平。

1.7 统计分析

所有数据以均数±标准差表示。组间差异比较用ANOVA 及Newman-Student 多重比较t 检验分析，由SPSS13.0 统计软件完成。双侧P＜0.05 为差异有统计学显著意义。

2 结果

2.1 不同浓度AGEs 对软骨细胞TNF-α 及MMP-13表达的影响

与AGEs 共孵育48 h 后，软骨细胞TNF-α 及MMP-13 mRNA的表达随AGEs 浓度增加而增高，较正常对照组均明显升高(P＜0.05)，以AGEs 浓度为100μg/mL 时作用最明显。BSA 对照组与正常对照组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。(见图1、2)

图1 不同浓度的AGEs 对软骨细胞TNF-αmRNA表达的影响与正常对照组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

图2.不同浓度的AGEs对软骨细胞MMP-13mRNA表达的影响与正常对照组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

2.1 不同浓度的AGEs 对软骨细胞CAT、SOD 活性及MDA 含量的影响

不同浓度的AGEs 与软骨细胞共孵育48h 后，浓度依赖性地使软骨细胞CAT(见图3)，SOD(见图4)活性降低，MDA 含量增多(见图5)，与正常对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05 或P＜0.01)，且均以AGEs 浓度为100 μg/mL 时作用最明显。

图3.不同浓度的AGEs 对软骨细胞CAT 活性的影响与正常对照组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

图4.不同浓度的AGEs 对软骨细胞SOD 活性的影响与正常对照组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

图5.不同浓度的AGEs 对软骨细胞MDA 含量的影响与正常对照组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

2.2 不同浓度的AGEs 对体外培养软骨细胞ROS水平的影响

不同浓度的AGEs 与软骨细胞共孵育48h 后，浓度依赖性地使软骨细胞内ROS的含量增加，与正常对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)，且以AGEs 浓度为100μg/mL 时作用最明显(见图6)。

图6.各组ROS 生成情况荧光照片及统计图。vs 与正常对照组比较，+P<0.05，++P<0.01

2.3 Anti-RAGE和PDTC 对AGEs 诱导软骨细胞TNF-α 及MMP-13表达的影响

分别加入Anti-RAGE 及PDTC 处理后，再加入作用最显著浓度AGEs(100μg/ml)与软骨细胞共同孵育48h 后，TNF-α 及MMP-13表达明显低于AGEs 单独处理组(P＜0.01)，与正常对照组差异无统计学意义(P＞0.05)(见图7、8)。

图7.Anti-RAGE和PDTC 对AGEs 诱导软骨细胞产生的TNF-α的影响

图8.Anti-RAGE和PDTC 对AGEs 诱导软骨细胞产生的MMP-13的影响

3 讨论

OA 发生的本质是在机械性和生物性因素共同作用下，关节软骨细胞、细胞外基质和软骨下骨的降解与合成的生理平衡失调的结果，其病理生理过程主要表现为关节软骨的分解代谢明显大于合成代谢。关节发生OA 时，各种间质金属蛋白酶(MMP)表达和含量增高，使得软骨间质的分解增加，而软骨间质分子的降解产物自身又可促进进一步地降解，从而形成持续性的恶性循环。其中，MMP-13 是裂解II 型胶原作用最强的酶[4]，在OA的发生发展过程中起着重要的作用。另外在OA 病变的过程中，病变局部分泌一些细胞因子对关节软骨和滑膜具有明显的破坏作用，TNF-α 是OA的发病过程中最早出现的细胞因子[5]，其作用尤为重要。因此本研究选择MMP-13和TNF-α 作为反映OA病变主要检测指标。

OA的发病机制复杂，目前已知OA的发生与遗传、发育、代谢和创伤等诸多因素有关，而年龄被公认为是骨关节炎的最突出的启动和进展的危险因素之一。近年来越来越多的研究显示，AGEs 与OA的发生发展有着密切的关系，甚至有学者认为AGEs 是OA年龄风险因素的分子学机制关键所在[2]。一方面AGEs 可以使关节软骨胶原糖化、交联及基质中蛋白多糖(Proteoglycan)合成减少，导致基质脆性增加，抗压力和剪切力能力明显降低，进而使关节软骨变硬，变脆，因此即使在正常生理负重范围时关节软骨也会出现损伤。另一方面AGEs在正常机体内生成具有不可逆性，其过程随着年龄的增长或体内有高血糖、氧化应激、炎症等情况时加速，并具有一但形成就难以分解的特性，因此AGEs 形成抑制剂(如：氨基胍)或交联抑制剂(如：ALT-711)等只能对新生成的AGEs 产生作用，不能降解已产生的AGEs，虽能延缓和改善OA 患者的关节病变但不能完全中止OA的进展[6]。故而推测除通过交联改变软骨基质力学性质致病外，还有其他的持续性致病机制存在，即细胞内信号通路的持续活化，然而具体的机制尚不明了。由于AGEs的结构复杂，分子量大，机体很难将其自行清除体外，形成恶性循环，会促进更多的AGEs 产生和积聚，这可以解释为什么骨关节炎与年龄相关并呈进行性发展，这也是糖尿病患者在严格控制血糖后骨关节炎病变仍继续进展重要原因之一，因为即使纠正血糖后，AGEs 对关节软骨的损伤仍会存在[7-8]。

在对其他慢性疾病的研究中发现，AGEs 可以通过与特异受体相互作用，产生多效性反应，它可能提高细胞内ROS 水平和激活核转录因子NF-κB信号通路，从而改变许多分子的基因表达水平导致细胞损伤[9-10]。有研究证实AGEs 能诱导星状小鼠肝细胞和骨髓间充质干细胞中ROS 含量增多[11-12]，在血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、滑膜细胞上也均已证实AGEs 与RAGE 结合后，诱导细胞内ROS大量产生，激活NF-κB，导致炎症因子产生增多，最终引起一系列病理生理改变[13-14]。然而AGEs 在软骨细胞上的作用相关文献报导较少。本研究的结果显示AGEs 受体拮抗剂anti-RAGE 可以显著抑制由AGEs 诱导的软骨细胞TNF-α和MMP-13表达增多，说明AGEs 诱导软骨细胞TNF-α和MMP-13 高表达与其受体RAGE的活化有关，同时NF-ΚB的特异性抑制剂PDTC 亦可显著抑制AGEs 诱导的软骨细胞TNF-α和MMP-13表达增多，说明其信号转导通路与NF-κB的活化有关。为了探明AGEs 诱导软骨细胞TNF-α和MMP-13表达增多的机制是否与细胞内氧化应激有关，我们检测了不同浓度的AGEs 对软骨细胞CAT、SOD 活性及MDA、ROS 含量，以反应细胞氧化应激水平。结果显示不同浓度的AGEs 可以显著降低软骨细胞CAT和SOD的活性，明显升高细胞内MDA、ROS的水平，提示AGEs 可以诱导软骨细胞高表达TNF-α和MMP-13 可能与其促进细胞氧化应激有关。

总之，本研究通过体外培养的家兔软骨细胞模型，初步证明了AGEs 通过AGEs/RAGE/ROS/NF-B 细胞通路，诱导软骨细胞TNF-α和MMP-13表达增多，从而导致软骨细胞功能障碍，为防治由AGEs 所致OA 病变提供了实验依据。

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