IL-21、MMP-2 与TIMP-1 在哮喘小鼠小气道及肺组织中的表达及布地奈德干预后的影响

傅 丹，旷寿金，贺 亮，徐 畅

(1.娄底市中心医院，湖南 娄底 417000；2.中南大学湘雅三医院儿科，湖南 长沙40013；3.湖南省儿童医院呼吸科，湖南 长沙 410007)

支气管哮喘(Bronchial Asthma,Asthma)是儿童最常见的慢性疾病之一。其主要特征是慢性气道炎症与气道重塑。气道平滑肌的过度增生、肥大细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的降解与沉积失衡是气道重塑的重要特征[1]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs) 是ECM 代谢的主要限速酶，在气道重塑中起重要作用。损伤的气道上皮表达高水平的MMP-2，可促进其下方的成纤维细胞(fibroblast,FB)增殖[2]。FB 可分泌MMPs 及其组织抑制剂-基质金属蛋白酶组织抑制剂-1 (tissue inhibitor of matrix metallo-proteinases-1,TIMP-1)[3-4]。有文献报道，气道重塑中存在MMP 与TIMP表达上调，MMP/TIMP 比值和气道重塑的严重程度呈正相关[5]。白细胞介素21(interleukin21,IL-21)是一个具有多功能、多效性的细胞因子，属于IL-2 超家族，其广泛参与了人的免疫调节[6]，在自身免疫性及变态反应性疾病的发生中起着重要作用。有学者对炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)的研究发现，IL-21 能促进肠FB 分泌MMP-2[7]。IL-21 还能降低血浆IgE的水平，哮喘发作期患儿外周血IL-21的水平低于哮喘缓解期与健康儿童[8-9]。但IL-21 在不同的免疫背景下，表现不同的作用。在哮喘这一免疫环境下，IL-21 能否影响FB 合成、分泌MMP，改变MMP/TIMP 比值而参与气道重塑，目前无相关研究。本研究拟建立小鼠哮喘模型，观察哮喘小鼠小气道及肺组织中IL-21、MMP-2 及TIMP-1的表 达；探 讨IL-21 能 否 对MMP-2的分泌产生影响，能否改变MMP-2/TIMP-1比值；吸入布地奈德能否对IL-21 水平产生影响。

1 材料与方法

1.1 材料

36 只雌性清洁级、周龄7～8 周、体重18～22g、BALB/c 小鼠，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。OVA 购自美国Sigma 公司，IL-21 单克隆抗体购自美国abcam 公司，布地奈德购自阿斯利康公司。PCR 仪由美国ABI 公司生产。

1.2 方法

1.2.1 动物分组

36 只雌性BALB/c 小鼠随机均分为3组：生理盐水对照组(CTRL组)、OVA 致敏、激发哮喘组(OVA组)、布地奈德干预组(OVA+BUD组)。

1.2.2 哮喘模型的建立 按Jason Temelkovski等所提出的方法[9]，建立OVA 激发的小鼠哮喘模型。CTRL组小鼠以等量生理盐水代替OVA 进行腹腔注射及雾化，OVA+BUD组小鼠在每次OVA雾化前1 h，予布地奈德1 mg 雾化30 min。在末次激发后的24 h 内取左、右肺组织。将左肺组织置于液氮中，保存于-80.0℃超低温冰箱中待检。将右肺组织依次行固定、脱水、包埋、切片、摊片、捞片、烘片等程序，制备肺组织标本。

1.2.3 HE、Masson 染色观察各组小鼠小气道及肺组织病理变化；免疫组化检测MMP-2、TIMP-1的表达；RT-PCR 测定IL-21mRNA的表达。

1.3 统计学分析

计量资料以均数±标准差表示。两组间均数比较采用独立样本t 检验；多组均数比较采取单因素方差分析；相关性研究采用Pearson 相关检验。以P＜0.05 作为判断差异显著性的标准。统计学分析以SPSS18.0 软件和GraphPad Prism5.0 进行分析。

2 结果

2.1 三组小鼠HE 染色、Masson 染色情况

肺组织石蜡切片HE 染色显示OVA组小气道及肺组织上皮细胞脱落、坏死、结构紊乱，杯状细胞增生，气道黏膜皱襞增多、增厚，支气管、血管周围炎性细胞浸润，肺泡间隔增宽，肺泡壁变薄、甚至断裂；Masson 染色OVA组小气道及血管周围可见较多胶原纤维沉积，证明哮喘小鼠模型制作成功。OVA+BUD组上述表现明显轻于OVA组。CTRL组HE 染色小气道及肺组织上皮细胞正常，支气管、血管周围无炎性细胞浸润，肺泡壁完整；Masson 染色小气道周围无明显胶原纤维沉积，血管周围仅见少许胶原纤维沉积(见图1，2)。

图1 各组小鼠小气道及肺组织HE 染色显示的病理改变(×100)

图2 各组小鼠小气道及肺组织Masson 染色显示的病理改变(×100)

2.2 免疫组化检测三组小鼠MMP-2、TIMP-1 蛋白表达及MMP-2/TIMP-1 比值的比较

OVA组中MMP-2 与TIMP-1的表达、MMP-2/TIMP-1 比值，均高于CTRL组与OVA+BUD组，其差异有统计学意义(P＜0.05)；CTRL组与OVA+BUD组比较，其差异无统计学意义(P＞0.05)。见图3、4，表。

图3 各组小鼠小气道及肺组织MMP-2 蛋白表达情况(×100)

表1 各组小鼠小气道及肺组织MMP-2、TIMP-1、MMP-2/TIMP-1 比值棕黄色染色区域所占镜下面积的比值比较(n=12)

图4 各组小鼠小气道及肺组织TIMP-1 蛋白表达情况(×100)

2.3 RT-PCR 检测三组小鼠小气道及肺组织IL-21mRNA的表达

以GAPDH 为内参，以IL-21mRNA 与GAPDH灰度值比值的平均值来反映IL-21mRNA的表达水平。OVA组IL-21mRNA的表达水平低于CTRL组与OVA+BUD组，其差异有统计学意义(P＜0.05)；CTRL组高于OVA+BUD组，其差异有统计学意义(P＜0.05)。见图5，表2。

图5 各组小鼠小气道及肺组织IL-21 mRNA的表达

表2 各组小鼠小气道及肺组织IL-21mRNA表达比较(n=12)

2.4 相关性分析结果

以各组小鼠小气道及肺组织中IL-21mRNA的灰度值比为横坐标，分别以MMP-2 染色阳性区域所占镜下面积的比值为纵坐标，行线性相关分析，两者呈负相关(r=-0.713，P＜0.01)；以TIMP-1染色阳性区域所占镜下面积的比值为纵坐标，两者呈负相关(r=-0.770，P＜0.01)；以MMP-2/TIMP-1 比值为纵坐标，两者呈负相关(r=-0.729，P＜0.01)。

3 讨论

哮喘的发病机制复杂，目前尚未明确。多种炎性细胞(包括T、B 淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等)及其合成、释放的多种炎性介质(如白细胞介素、组胺、白三烯及前列腺素等)均参与了哮喘的发病过程。目前研究认为，Th2 细胞分泌的一些细胞因子(如IL-2、IL-4、IL-13 等)和基质金属蛋白酶(如MMP-2、MMP-9 等) 在哮喘的慢性炎症和气道重塑中起着重要的作用[11-13]。

气道重塑是哮喘重要的病理特征之一。MMPs是一类结构具有高度同源性的内肽酶家族的总称，其可分解ECM，在炎症反应、细胞迁移、组织重塑、血管生成和伤口愈合等多种生理病理过程中起着重要作用[14]。MMPs 可促进上皮下FB 活化、增殖，胶原纤维大量增生，基底膜及气道平滑肌肥厚、增殖，最终导致气道重塑[15]。气道重塑的过程也是MMPs 在气道壁沉积的过程[3]。基质金属蛋白酶-2(MMP-2)是MMPs 家族中的胶原明胶酶，既能降解变性的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原明胶，又可切割天然的Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅺ型胶原。MMP-2 可通过激活与ECM 生长有关的因子释放，诱导细胞增殖、分化而参与气道重塑；同时还可降解血管及上皮下胶原成分，促进新的血管及上皮形成，导致气道纤维化。TIMP 是目前研究发现的MMPs 活性的主要抑制剂之一，有TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3 及TIMP-4 四型。其通过与MMPs的催化位点相结合，使其失活，或与酶原的某些位点相结合，阻碍其继续活化的方式来调控MMPs的活性[3]。

MMP-2 在气道与肺组织中表达上调、与其抑制物TIMP的比值失衡是导致哮喘气道重塑的原因之一[16-17]。本研究通过建立小鼠哮喘模型，观察哮喘小鼠小气道及肺组织中MMP-2、TIMP-1的表达及二者的比值变化情况，发现小鼠被OVA 致敏、激发后，出现了烦躁不安、喘鸣、呼吸困难等表现，其小气道及肺组织上皮细胞出现了结构紊乱，部分上皮细胞坏死、脱落；气道平滑肌增生；气道与肺组织中有较多的胶原沉积，这部分小鼠出现了气道重塑；而CTRL组并未出现上述结构改变，提示无气道重塑的发生；而OVA+BUD组上述改变均轻于OVA组。检测各组的MMP-2、TIMP-1的表达及二者比值的变化发现，OVA组MMP-2 与TIMP-1的表达、MMP-2/TIMP-1比值均高于CTRL组和OVA+BUD组。提示MMP-2的表达上调，MMP-2 与TIMP-1 比值失衡可能在哮喘的气道重塑中起一定作用。本研究结果还显示，布地奈德可能通过下调MMP-2 与TIMP-1的表达，恢复MMP-2/TIMP-1的平衡来抑制气道重塑。

IL-21 是2000年发现的一种细胞因子，为I型细胞因子[17]。它主要来源于被激活的CD4+T 细胞，而NKT 细胞、Thl7 细胞、Tfh 细胞及CD8+T 细胞被激活后或在某些特定条件下也可以产生一定量的IL-21[19-20]。IL-21 能调节T、B和NK 细胞的增殖、分化[21]。IL-21 与IL-2 超家族的其他成员(IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15) 具有共同的γ 链细胞因子受体γc。IL-21 与IL-2、IL4和IL-15 等一样，信号传导途径均为JAK／sTAT 通路，但与其它IL-2超家族细胞因子主要激活sTAT5 途径不同，它虽然也能激活该通路，但相对较弱，其主要的信号传导通路为JAKl、JAK3/sTATl和sTAT3[22-23]。还有研究认为，sTATl 对细胞生长、存活主要起着负性调控，而sTAT3和sTAT5 对细胞的存活、分化则能起促进作用[24]。因此，IL-21的免疫调节作用较为复杂，既可促进又可抑制免疫反应，而其最终表现为促进还是抑制，则受不同免疫背景的影响。

研究发现，哮喘患儿血浆总IgE 水平越高，哮喘发生率越高，其病情亦越严重[25]。国内学者研究证实，哮喘患者外周血IL-21 水平与总IgE 水平呈负相关[26]。因此，IL-21 可能通过对IgE的负向调控，而对哮喘的发生起到一定的抑制作用。

在某些免疫环境下，IL-21 对MMP-2的分泌可起促进作用[27]。但本研究发现，在哮喘这一免疫环境中，MMP-2的表达上调，而OVA组IL-21的表达却低于CTRL组与OVA+BUD组，IL-21 与MMP-2的表达、MMP-2/TIMP-1 比值呈负相关。这一结果提示，在哮喘这一免疫背景下，IL-21 可能并没有对MMP-2的分泌起到促进作用。

哮喘与过敏性鼻炎均属于变态反应性疾病。国外学者研究发现，予重组鼠IL-21(recombinant mouse IL-21,rmIL-21)后，过敏性鼻炎小鼠鼻腔组织中Th2 细胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)的表达水平下调[28]。予重组IL-13(rIL-13)后，哮喘小鼠气道平滑肌和肺成纤维细胞的MMP-2mRNA表达上调[29]。因此，IL-21 可能通过调控IL-13的水平，而影响肺组织MMP-2的表达，从而影响气道重塑。

有研究发现，吸入沙美特罗/氟替卡松可降低哮喘患者外周血IL-21的水平，但机制尚不明确[26]。还有学者对SLE的研究发现，Tfh 细胞可以产生IL-21，糖皮质激素可以通过促使Tfh 细胞的凋亡，从而降低外周血IL-21的水平[30]。本研究发现，OVA+BUD组小气道及肺组织IL-21表达低于CTRL组，但高于OVA组；吸入布地奈德后，IL-21的水平并没有降低，反而有所上调。这提示在不同的免疫背景下，IL-21 扮演着不同的角色。OVA组IL-21的表达低于CTRL组与OVA+BUD组；IL-21 与MMP-2、TIMP-1的表达及MMP-2/TIMP-1 比值均呈负相关；予布地奈德干预后，可以上调IL-21的表达。这提示IL-21 可能是哮喘治疗的一个潜在靶点。

[1]张坚松,王悦,向阳,等.哮喘患儿可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅰ的表达[J].湖南师范大学学报(医学版),2005,2(2)：4-6.

[2]陈兴无,徐军.气道上皮损伤对上皮下成纤维细胞转分化的影响及其在支气管哮喘气道高反应发生中的地位[J].中华结核和呼吸杂志,2005,28(10)：312-316.

[3]叶新民,钟南山.基质金属蛋白酶与支气管哮喘气道重塑[J].中华哮喘杂志,2009,3(5)：367-371.

[4]吴祖群,李海浪.成纤维细胞和气道重建[J].国外医学(呼吸系统分册),2000,20(3)：146-147.

[5]Swartz MA,Tschumperlin DJ,Kamm RD et al.Mechanical stress is communicated between different cell types to elicit matrix remodeling [J].Proc Natl Acad Sci U S A,2001,98(11)：6180-6185.

[6]Monteleone G,Pallone F,Macdonald TT,et al.Interleukin-21 as a new therapeutic target for immune -mediated diseases[J].Trends Pharmacol Sci,2009,30(8)：441-447.

[7]Monteleone G,Monteleone I,Fina D,et al.Interleukin-21 enhances T-helper cell type I signaling and interferongamma production in Crohn's disease [J].Gastroenterology,2005,128(3)：687-694.

[8]李会娟,彭韶,梁鹏,等.支气管哮喘患儿外周血辅助性T淋巴细胞17、白细胞介素-17、白细胞介素-21 水平变化[J].实用儿科临床杂志,2011,26(9)：677-679.

[9]Suto A,Nakajima H,Hirose K,et al.Interleukin 21 prevents antigen -induced IgE production by inhibiting germ line C (epsilon) transcription of IL-4-stimulated B cells[J].Blood,2002,100(13)：4565-4573.

[10]Temelkovski J,Hogan SP,Shepherd DP,et al.An improved murine model of asthma：selective airway inflammation,epithelial lesions and increased methacholine responsiveness following chronic exposure to aerosolised allergen[J].Thorax,1998,53(10)：849-856.

[11]Doucet C,Brouty-Boyé D,Pottin-Clemenceau C,et al.IL-4 and IL-13 specifically increase adhesion molecule and inflammatory cytokine expression in human lung fibroblasts [J].Int Immunol.1998.10(10)：1421-1433.

[12]Steinke JW,L.Borish.Th2 cytokines and asthma.Interleukin-4：its role in the pathogenesis of asthma,and targeting it for asthma treatment with interleukin -4 receptor antagonists[J].Respir Res,2001,2(2)：66-70.

[13]Gueders MM,Foidart JM,Noel A,et al.Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of MMPs in the respiratory tract：potential implications in asthma and other lung diseases [J].Eur J Pharmacol,2006,533(1-3)：133-144.

[14]袁益明,王曾礼,董碧蓉.地塞米松调节基质金属蛋白酶-2 对哮喘大鼠气道重建的影响[J].四川大学学报(医学版).2003,34(4)：103-107.

[15]Greenlee KJ,Z Werb,F.Kheradmand.Matrix metalloproteinases in lung：multiple,multifarious,and multifaceted.Physiol Rev [J].2007,87(1)：69-98.

[16]Cataldo DD,Gueders M,Munaut C,et al.Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of matrix metalloproteinases mRNA transcripts in the bronchial secretions of asthmatics[J].Lab Invest,2004,84(4)：418-424.

[17]刘晓湘,曹德寿,齐金萍,等.哮喘豚鼠下呼吸道MMP-2的表达及NGF的调节作用[J].解剖科学进展,2005,11(4)：408-411.

[18]Parrish-Novak J,Foster DC,Holly RD,et al.Interleukin-21 and the IL-21 receptor：novel effectors of NK and T cell responses[J].J Leukoc Biol,2002,72(5)：856-863.

[19]Spolski R,Leonard WJ.Interleukin-21：basic biology and implications for cancer and autoimmunity [J].Annu Rev Immunol,2008,26：57-79.

[20]丁艳荣,黄长形.白细胞介素21的生物学特性及其研究进展[J].国际流行病学传染病学杂志,2010,37(2)：121-124.

[21]Parrish-Novak J,Dillon SR,Nelson A,et al.Interleukin 21 and its receptor are involved in NK cell expansion and regulation of lymphocyte function [J].Nature,2000,408(6808)：57-63.

[22]Strengell M,Sareneva T,Foster D,et al.IL -21 up -regulates the expression of genes associated with innate immunity and Th1 response [J].J Immunol,2002,169(7)：3600-3605.

[23]Strengell M,Matikainen S,Sirén J,et al.IL-21 in synergy with IL-15 or IL-18 enhances IFN-gamma production in human NK and T cells [J].J Immunol,2003,170(11)：5464-5469.

[24]Bromberg J,Darnell JJ.The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function[J].Oncogene,2000,19(21)：2468-2473.

[25]Corrigan C.Mechanisms of intrinsic asthma [J].Curr Opin Allergy Clin Immunol,2004,4(1)：53-56.

[26]李开艳,熊盛道,朱晶,等.沙美特罗/氟替卡松对支气管哮喘患者血清IL-21 与总IgE 水平的影响.医药导报[J].2011(8)：92-96.

[27]Monteleone G,Caruso R,Fina D,et al.Control of matrix metalloproteinase production in human intestinal fibroblasts by interleukin 21[J].Gut,2006,55(12)：1774-1780.

[28]Hiromura Y,Kishida T,Nakano H,et al.IL -21 administration into the nostril alleviates murine allergic rhinitis[J].J Immunol,2007,179(10)：7157-7165.

[29]Corry DB,Rishi K,Kanellis J,et al.Decreased allergic lung inflammatory cell egression and increased susceptibility to asphyxiation in MMP2-deficiency [J].Nat Immunol,2002,3(4)：347-353.

[30]Feng X,Wang D,Chen J,et al.Inhibition of aberrant circulating Tfh cell proportions by corticosteroids in patients with systemic lupus erythematosus [J].PLoS One,2012,7(12)：5-19.