一株橡胶树白粉病生防菌的鉴定及在橡胶树叶片定殖规律研究

黄有航， 谭志琼， 王寅寒， 张荣意

（海南大学热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室／海南大学环境与植物保护学院，海口 570228）

橡胶树白粉病自1918年在爪哇首次报道后，已遍及世界所有植胶园［1］，是橡胶生产上的重要叶部病害，危害橡胶树新抽叶片，造成大面积落叶，严重影响干胶产量［2］。目前对白粉病的防治主要采用化学防治为主，但大量化学药剂的使用对人畜产生一定的毒害且造成严重的环境污染，同时会导致病原菌产生抗药性。目前国内外将芽胞杆菌作为生防因子来防治白粉病的研究主要集中在小麦白粉病和瓜类作物白粉病。宫宇飞［3］从小麦组织中分离到一株对小麦白粉病有很好防治作用的内生芽胞杆菌E1R－J，1%的粗蛋白提取液对小麦白粉病的抑制率能够达到86.44%，10%发酵滤液的抑制率能够达到100%。胡莎［4］等从土壤中分离到芽胞杆菌菌株SN1、SN11，盆栽试验中治疗效果达到83.81%、73.53%，预防效果达到91.72%、87.78%。美国 Agraquest公司［5］将生防菌株枯草芽胞杆菌QST713制成生物农药，可以用于防治多种植物病害，是一种广谱生物杀菌剂，其中包括防治小麦白粉病和瓜类作物白粉病。对于橡胶树白粉病生防菌研究国内外未见报道。

枯草芽胞杆菌［Bacillus subtilis（Ehrenbery）Cohn］对多种植物真菌病害具有很好的拮抗作用，又是自然界中广泛存在的非致病细菌，同时可以在植物体内定殖，对人畜无害［6］。芽胞杆菌的生防机制主要是拮抗作用、诱导抗性、竞争作用。对植物病原真菌有显著抑制活性的主要是非核糖体合成的脂肽类抗生素。伊枯草菌素（iturin）是目前枯草芽胞杆菌拮抗物质中研究较多的抗生素，它是枯草杆菌产生的一大类脂肽类化合物，包括IturinA、B、C、D、E［7－8］。其中IturinA的活性最高，它不仅对真菌有拮抗作用，对部分细菌也有拮抗效果。国外学者从枯草芽胞杆菌KS03菌种中分离到化合物伊枯草菌素A2其分子量大小1042Da［9］。

本研究从胶园土壤中分离到对橡胶树白粉病有很好抑制作用的拮抗菌株并进行鉴定，同时研究其在橡胶叶片上的定殖规律。

1 材料与方法

1.1 供试菌株、培养基

橡胶粉孢（Oidium heveae B.A.Steinm.）采自海南大学环境与植物保护学院教学基地，采回后采用单斑分离法得到纯化菌株，并保存在橡胶树幼苗上。

分离筛选拮抗菌的培养基为NA培养基［10］。

1.2 拮抗菌的分离和筛选

从海南橡胶园取橡胶根际7～10cm土壤样品，分别称取5.0g置于50mL无菌水中，在200r／min摇床振荡10min后静置，取上清液稀释成10－2、10－3、10－4，取20μL混合于 NA 培养基倒平板，30℃恒温培养1d后连续挑取形态完整、差异明显的单菌落纯化后保存。

采用杨意伯［11］等的方法进行孢子萌发试验和室内盆栽试验，计算孢子萌发抑制率和防效。同时设置丙环唑（10% 乳油，自研，施药浓度50μg／mL）作为防效测定的对照。

1.3 拮抗菌株的鉴定

1.3.1 拮抗菌的生理生化特性测定

参照文献的方法［12］，对菌落、菌体、芽胞、鞭毛、氧化酶、硝酸盐还原、葡萄糖氧化发酵、淀粉水解、37℃生长、43℃生长、明胶液化、5%NaCl生长、7%NaCl生长、葡萄糖产酸、乙酰甲基甲醇（V.P.）、pH5.7生长、柠檬酸盐、接触酶、阿拉伯糖产酸、吲哚产生、酪氨酸分解、丙二酸盐、厌氧生长、甲基红（M.R.）进行测定。以枯草芽胞杆菌为对照菌［13－14］，同时进行各性状的测定，以验证方法的正确性。

1.3.2 拮抗菌株gyrB基因序列测定

根据文献报道的gyrB 基因引物［15］UP－1s，5′－GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA－3′，引物 UP－2Sr，5′－CGGCTACCTTGTTACGACTT－3′。PCR反应体系：2×PCR－Mixture 25μL，引物各1μL，总DNA 2μL，ddH2O 21μL，总体积50μL。PCR反应条件：预变性，94℃4min；变性，94℃30s；退火，50℃30min；延伸，72℃45s；30个循环后72℃10 min，4℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将所得序列在GenBank数据库注册登记，应用ClustalX比对。用软件DNAMAN V6构建系统发育树。

1.4 拮抗菌抗利福平标记

参照吴蔼民的方法［16］，取20μL拮抗菌株的NB培养液涂在含一定量利福平的NA平板上，28℃培养2～3d挑取单菌落，将得到的新菌株逐级诱导，利福平浓度分别为1、5、10、15、20、50、100、200μg／mL和300μg／mL，直至最后筛选出抗利福平浓度为300μg／mL的突变体菌株。

1.5 抗利福平菌株耐药稳定性测定

参照吴胜春的方法［17］，将抗利福平菌株在 NA培养基上连续传代20次后，接种到NB培养基中培养24h，然后涂于含300μg／mL利福平的NA培养基上，观察其生长情况。

1.6 抗利福平菌株对橡胶树白粉病的拮抗作用

抗利福平菌株通过孢子萌发试验和盆栽试验［11］，计算孢子萌发抑制率和防效。

1.7 抗利福平菌株在橡胶叶片上的定殖

取于30℃条件下培养48h的抗利福平菌株发酵液1mL，用小型喷雾器将菌液喷洒于橡胶树淡绿叶上，使雾滴均匀地喷洒在叶面，但不形成液滴滴落，每次处理共30片叶；伤叶处理用石英砂处理橡胶淡绿叶表面后再喷洒发酵液；设无菌水为对照，每个处理3个重复，待叶片干燥后置于30℃温室培养。分别在处理后1、3、5、7、10、15、20d后任取3片叶进行标记菌分离。

将处理后的叶片称取1g，剪碎研磨后加入10mL无菌水混合振荡10min，将混合液稀释至10－3，取其中100μL均匀涂于利福平300μg／mL培养基平板上，30℃恒温黑暗培养，24h后计数。根据每皿中的菌落数量，计算每克鲜叶片中所含的菌量，计数结果用（cfu／g）来表示。

2 结果与分析

2.1 拮抗细菌的分离

从海南橡胶园取橡胶根际土壤100份，分离到细菌276株，通过初筛和复筛得到拮抗效果稳定的菌株5株。通过孢子萌发试验，对白粉病孢子萌发抑制率均大于70%，其盆栽试验防效均达到60%，其中S43的抑制效果最好，孢子萌发抑制率达到86.34%，防效达到86.54%，对白粉病的防效和丙环唑比较无显著差异，见表1。因此本文选取S43进行进一步研究。

表1 5株拮抗菌对白粉病的拮抗效果1）Table 1 Antagonistic efficacy of five antagonistic bacterial strains to the powdery mildew

2.2 拮抗菌株S43的鉴定

2.2.1 菌体特征和菌落特征

在NA平板上S43菌落白色，圆形，边缘不整齐，表面有皱纹。菌体呈杆状，周生鞭毛，革兰氏染色阳性，产芽胞，芽胞椭圆形、中生、不膨大。

2.2.2 生理生化特性测定结果

拮抗菌株S43的生理生化特征测定结果如表2所示。

表2 S43主要生理生化特征1）Table 2 Main physiological and biochemical features of the strain S43

2.2.3 gyrB基因序列分析

将S43的促旋酶（gyrase）的B亚单位基因序列提交GenBank数据库，序列大小为1201bp，将得到的序列与芽胞杆菌属菌株做BLAST比对，发现与其同源性较高的菌株为枯草芽胞杆菌（见图1）。

图1 S43系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of the strain S43

综合形态特征、生理生化特征和gyrB基因序列分析，对照文献［13－14，18－19］，将该菌株鉴定为枯草芽胞杆菌。

2.3 抗利福平菌株的获得及耐药稳定性测定

将抗利福平筛选获得的菌株在NA平板上培养20代后，用牙签任意挑取单菌落，接种于含利福平300μg／mL培养基上培养，均能正常生长，说明标记菌株具有很好耐药稳定性。将利福平诱导获得的菌株编号为S43＊。

2.4 菌株S43＊对橡胶树白粉病的拮抗作用

孢子萌发试验和盆栽试验表明，S43＊对白粉病孢子萌发抑制率为85.00%，防效为86.12%，拮抗效果基本与原始菌株S43接近。

2.5 菌株S43＊在橡胶叶片上的定殖与消长动态

对橡胶叶片进行伤叶和不伤叶处理均能分离到标记菌株，对照未出现任何细菌菌落，说明标记菌株S43＊能在橡胶叶片上定殖。

两种处理标记菌株在橡胶叶片的定殖动态如图2所示，接种后第1天叶片上的标记菌量达到最大，伤叶处理定殖量要比不伤叶处理定殖量大一倍，随着时间的推移标记菌株的定殖数量持续下降，在接种后第1天到接种后第5天，菌量下降最快，接种10d后，菌量下降速率变慢，接种后15d菌量开始保持稳定。

图2 伤叶和不伤叶处理标记菌株S43＊在叶片上的定殖动态Fig.2 Colonization dynamics of the marked strain S43＊ on injured and non－injured leaves

3 结论与讨论

gyrB即促旋酶（gyrase）的B亚单位基因，是编码DNA负超螺旋的拓扑异构酶—DNA促旋酶的B亚单位蛋白［20］。由于16SrDNA具有高度保守性，且分子量小，包含信息小，对于亲缘较近的菌属，分辨率不高。gyrB基因存在于大多数细菌中，且不会发生频繁的水平转移，在不同的蛋白及蛋白的不同位点，其氨基酸替代率也不相同。因此gyrB基因可以应用于细菌的系统发育学，特别是在近缘种区分及鉴定。

本试验从橡胶根际土壤中筛选到一株对橡胶白粉病有较好拮抗作用的菌株S43，根据形态特征、生理生化特征并结合gyrB基因序列比对，将S43菌株鉴定为枯草芽胞杆菌。

作为生防菌株，应该选择定殖速度快、定殖量大、营养需求低、存活能力强、存活时间久的有益微生物。生防菌株在植物体内定殖是一个复杂的过程，受诸多因素的影响。除了菌株本身原因外，植物组织结构、外部环境的不同都对定殖产生影响。对定殖规律的深入研究，揭示定殖过程中诸多影响因子，有助于生防菌更好地应用于农业生产上［21］。

本试验对标记菌株S43＊进行定殖规律研究，研究表明，标记菌株S43＊能在橡胶叶片上较好地定殖。在接种后第1天，菌量达到最大，但随着时间的推移，菌量逐渐减少，接种15d后，菌量基本保持稳定。伤叶接种和不伤叶接种10d以后叶片标记菌量相差不多。其中伤叶处理在接种初期叶片标记菌的定殖量要高于不伤叶处理，但随着时间推移，两种处理叶片上最终定殖菌量相差不多。自然定殖的芽胞杆菌的数量，涉及橡胶叶片上微生态学的研究，不是本论文的研究重点，我们的拮抗芽胞杆菌含有利福平抗性标记，自然定居的芽胞杆菌不影响本研究的结果。

寄主表面存在伤口，伤口成为细菌入侵的通道，伤口渗出物成为细菌生存的营养物质，从而促进细菌的定殖，故伤叶处理比不伤叶处理定殖率要高。但是由于寄主本身生理学性状会决定其内部环境中生存的种群数量大小，且侵入细菌会与植物内部已定殖的其他微生物之间存在竞争、拮抗、互利等诸多关系，最终会导致植物体内菌群数量趋于稳定。

本研究所采用的分离标记菌株的方法，只能分离耐药性的菌株，并不能证明两株标记菌株是橡胶叶片上的内生细菌。对于这两株是否可以作为内生细菌，需进一步研究。

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