建兰花叶病毒外壳蛋白基因和3′UTR序列测定与分析

郑国华， 苏勇波， 郑志忠， 彭德伟， 明艳林＊

（1.厦门华侨亚热带植物引种园，国家农作物国外引种隔离检疫基地，厦门市引种检疫与植物源产物重点实验室，厦门 361002；2.厦门兆翔花卉科技有限公司，厦门 361010）

建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus，CyMV）属于马铃薯X病毒属（Potexvirus）成员，是危害兰科植物最为严重的病毒之一［1］。调查表明国内兰花普遍受到该病毒的危害，特别是蝴蝶兰、文心兰、大花蕙兰、墨兰等兰花种类［2－3］。该病毒基因由约6200nt的单链正义RNA组成，5′端带有一个甲基化的核苷酸帽子结构，3′端带有一个poly（A），共编码RNA聚合酶、TGBp1、TGBp2、TGBp3和CP等5个蛋白［4］。Potexvirus属病毒的CP在病毒复制、组装和移动等过程中都发挥着重要的作用［5］，因此CP基因被广泛用于开展介导抗病毒研究［6］。国内外学者先后将CyMV的CP基因转入石斛兰（Dendrobium）原球茎［7］、本塞姆氏烟（Nicotiana benthamiana）［8］、西方烟（Nicotiana occidentalis）［9］等寄主，发现病毒的复制和积累受到明显抑制，展示了CP基因介导抗性的优势。但是在马铃薯Y病毒和番木瓜环斑病毒等CP基因介导应用研究中发现，CP基因介导的转基因植株对不同分离物的抗性存在着明显的差异［10－11］，从而限制了该抗性技术的应用。CyMV 分离物间CP基因（相似性85%～100%）存在明显遗传变异性［12］，因此有必要分析病毒CP基因遗传变异和进化趋势，寻找稳定遗传的保守序列开展抗性基因的研究。

正单链RNA病毒3′UTR的序列及其二、三级结构在病毒RNA复制酶启动合成负链RNA时具有非常重要的作用，许多研究发现3′UTR可以通过形成的茎环结构、类tRNA结构和Poly（A）等方式参与病毒复制调控［13］。目前，Potexvirus属的竹花叶病毒（Bamboo mosaic virus，BaMV）3′UTR结构与功能研究较为深入，BaMV的3′UTR能够形成类似三叶草茎环结构A、B、C和D，形成类似tRNA的假结结构［14］。RDRP能特异结合3′UTR，启动负链RNA的合成，敲除3′UTR不同部位都能影响RNA复制［15］。CyMV与BaMV同属于Potexvirus，具有非常相似的基因组成，因此研究CyMV 3′UTR的结构和功能将有可能进一步揭示病毒复制调控机制。

本文采用单链构象多态性分析（single－strand conformation polymorphism，SSCP）快速检测侵染不同蝴蝶兰品种CyMV存在的遗传变异，从中筛选得到5个存在变异的分离物并测定其CP和3′UTR基因序列。进一步与其他分离物的CP基因进行比较分析，研究CP基因存在的遗传多样性和作用于CP基因的选择压力，为开展抗病毒研究奠定基础。并通过软件预测3′UTR二级结构，以期为深入研究该复制调控区域的结构和功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 病毒毒源

蝴蝶兰病株采自厦门蝴蝶兰种植圃（品种编号：pl335、kq5503、kq6113、kf540、kf1023、jt1017、ypm166、j02037），均为组培分生苗，叶片出现褪绿、花叶和环斑等症状。经斑点酶联免疫检测筛选后，将病叶研磨后摩擦接种到曼陀罗上进行单斑分离和保存。采用接种建兰花叶病毒的曼陀罗病叶作为阳性对照，并以未接种病毒的曼陀罗叶片作为阴性对照。

1.1.2 试剂

CyMV斑点酶联检测试剂由本实验室制备。cDNA合成试剂盒、Taq聚合酶购自Promega公司。内切酶Pst I、T－A克隆试剂盒、感受态细胞JM109、Trizol试剂盒、DNA胶回收试剂盒等均购自上海生物工程有限公司。分析已知分离物间的保守序列，根据保守序列设计3条引物，委托上海桑尼生物工程有限公司合成。引物5Fa（对应AM055640的4900～4923nt）：5′－GTGTTAGCTTTTACTGCAGTGATC－3′、引物4R（与 AM055640的5278～5298nt 互 补 ）：5′－ATTGCCAGGATGGTAGGAAA－3′；引 物 M4T（与 poly（A）互 补 ）：5′－GTTTTCCCAGTCACGACTTTTTTTTTTTT－3′，其中5Fa／4R引物对预期扩增条带大小为399bp，5Fa／M4T引物对预期扩增条带约为1350bp。

1.2 方法

1.2.1 RT－PCR

采用Trizol试剂盒分别提取8个样品、阳性对照和阴性对照叶片总RNA，采用cDNA合成试剂盒合成cDNA。用5Fa／M4T引物对扩增部分TGB－ps、全长CP和3′UTR基因序列，PCR扩增体系如下：50μL 总体积包括 10 × PCR buffer 5μL、dNTP mix（10mmol／L）1μL、引物5Fa（10μmol／L）和 M4T（10μmol／L）各2μL、cDNA 1μL、Taq酶（5U／μL）0.4μL；补充ddH2O至50μL。PCR反应程序：94℃预变性10min，先进行94℃45s、50℃30s、72℃120s5个循环后将退火温度提高58℃再进行24次循环，最后72℃延伸5min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳观察。

1.2.2 SSCP

取PCR产物稀释1×105后作为模板，用5Fa／4R引物对扩增TGB部分序列，PCR扩增体系同1.2.1。PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃30s、58℃20s、72℃30s，共24个循环，72℃延伸5min。扩增产物经胶回收试剂盒回收纯化后，取纯化产物2μL加入4μL上样缓冲液（95%甲酰胺、0.5%溴酚蓝），混匀后于95℃变性10min，取出立即冰浴5min后上样。将电泳槽置于4℃冰箱内，先使用10V／cm电压电泳5min后，改用4V／cm电压电泳12h。EB染色30min后在紫外灯下观察。

1.2.3 序列测定与分析

将5Fa和M4T扩增得到的8份PCR产物经胶回收试剂盒回收纯化后，分别与pUCm－T载体进行连接转化DH5α，筛选得到pUmcy07（pl335）、pUmcy11 （kq5503）、pUmcy18 （kq6113）、pUmcy42（kf540）、pUmcy46（kf1023）、pUmcy54（jt1017）、pUmcy58（ypm166）和pUmcy59（j02037）等阳性克隆，委托上海生物工程有限公司进行序列测定。通过 Clustal Omega－Multiple Sequence Alignment（http：∥www.ebi.ac.uk／Tools／msa／）软件进行序列分析，通过基于Nei ＆Gojobori方法的SNAP在线分析软件（http：∥www.hiv.lanl.gov／content／sequence／SNAP／SNAP.html）分析CP基因各位点非同义置换率（dN）和同义置换率（dS）值。采用RNAshapes软件分析3′UTR形成的二级结构。

2 结果

2.1 RT－PCR扩增结果

经1%的琼脂糖凝胶电泳分析发现，采用5Fa和M4T这对引物从来自8个蝴蝶兰品种的CyMV分离物中均能扩增得到1300bp左右的目的条带。由于M4T引物与Poly（A）结合位点略有不同，扩增片段大小应该存在一定差异，但这种差异在电泳图中没有得到体现（图1）。PCR产物经稀释后作为模板采用5Fa和4R这对引物进行扩增均能得到400bp左右的目的条带（图2）。

图1 引物对（5Fa和M4T）PCR扩增产物电泳分析Fig.1 Electrophoresis of PCR products using the primers 5Fa／M4T

图2 引物对（5Fa和4R）PCR扩增产物电泳分析Fig.2 Electrophoresis of PCR products using the primer 5Fa／4R

2.2 变异分离物筛选

采用SSCP对5Fa和4R扩增得到的8个产物进行分析，发现经过优化SSCP条件均得到稳定的带型（图3）。8个分离物扩增片段均出现2个条带，总共有5个带型，其中kf1023、jt1017和ypm166带型一 致，kf540、j02037 带 型 一 致，pl335、kq5503、kq6113分离物带型差异明显。通过条带存在的多态性，推测这8个分离物由5种存在明显差异的分离物组成。进一步提取8个分离物重组质粒委托测序，结果表明5Fa和4R扩增片段大小均为399bp。通过序列分析比对发现，pUmcy46（kf1023）、pUmcy54（jt1017）和 pUmcy58（ypm166）序列一致，pUmcy42（kf540）、pUmcy59（j02037）序列一致，其他3个分离物各不相同（图4），与SSCP分析结果一致。

图3 PCR产物单链构象多态性电泳分析Fig.3 Electrophoresis of SSCP products of 8isolates

图4 8个分离物扩增片段碱基变异分析Fig.4 Molecular differentiation of 8isolates

2.3 CP基因进化树分析

根据SSCP分析和序列测定分析结果，本文对pl335、kq5503、kq6113、kf1023、j02037等分离物 CP基因进行分析，通过分析发现它们的相似性为95.5%～99.9%。从已知GenBank登录的130个分离物CP基因序列中选择具有代表性的56个登录序列和本研究的5个序列建立系统进化树（图5），分析表明这5个分离物都属于亚组A。其中pl335（图5：Phalaenopsis－pUmcy07）、kq6113（Phalaenopsis－pUmcy18）和 kf1023（Phalaenopsis－pUmcy46）3个分离物间相似性为99.4%～99.9%，与来自厦门（GQ507023）、广东（FJ356061）蝴蝶兰分离物亲缘性较近（相似性为98.1%～98.8%）。kq5503（Phalaenopsis－pUmcy11）和 j02037（Phalaenopsis－pUmcy54）2个分离物间相似性为97.6%。与来自浙江（DQ067884、DQ067885）、福建（DQ067879）、广东（AY360410）建兰分离物亲缘性较近（95.2%～97.6%）。分析分离物间的地理分布和寄主发现，各分离物间不存在明显的地域和寄主相关性。

2.4 CP基因dN和dS的分析

对CP基因各碱基非同义替代率（dN）和同义替代率（dS）进行计算，dN 平均为0.0418，dS平均为0.1205，平均dN／dS为0.3379，说明CP基因全长仍然为负向选择。通过SNAP分析的dN和dS分布（图6），可以看到CP的N端dN＞dS，表明受到正选择压力的作用，氨基酸发生变异的频率较高；而CP的C端dN＜dS，表明受到负选择压力的作用，在病毒进化过程中会净化这些变异。

图5 CP基因系统进化树分析Fig.5 Phylogenetic tree based on CP nucleotide sequences between different isolates of CyMV

2.5 3′UTR二级结构预测

分析3′UTR序列发现含有Potexvirus属病毒RNA合成必需的顺式元件“AC（C／T）TAA”和Poly（A）信号“AATAAA”。采用RNAshapes软件预测3′UTR形成的二级结构，发现该区域能够形成类似三叶草茎环结构（图7A），顺式元件位于茎环结构A中，推测该区域在启动负链RNA合成的过程中具有重要作用。

图6 CP基因核苷酸的非同义替代率（dN）和同义替代率（dS）Fig.6 Cumulative plot of average nonsynonymous nucleotide substitution（dN）and average synonymous nucleotide substitution（dS）represented codon by codon

进一步分析各分离物的3′UTR存在的遗传变异（图7B），发现10位（A／T）、28位（C／T）、31位（A／T／G）、47位（G／A）、59位（A／T／C）、60位（A／T／G）、61位（C／T）等变异位点均位于未配对区域，它们间的变异没有改变茎环结构；位于配对区域的49位（C／T）和68位（A／G）则是分别形成 A－T和G－C配对的稳定结构。56位碱基A出现缺失和突变为G的情况降低了茎环稳定性。由此可见，各分离物进化过程中始终保持这种二级结构的稳定，推测这种结构对病毒具有重要意义。

3 讨论

Zhou等［16］根据CP基因序列相似性进行进化树分析，认为CyMV分离物间亲缘关系与地理位置大体相关，亚洲各分离物和夏威夷分离物以很高相似系数聚集在一起，欧洲各分离物集成一大类，新加坡的一个分离物和泰国分离物是特例。Moles等［17］则明确这两类分离物划分为亚组A和亚组B。本文通过将这5个分离物与其他分离物进行比对，结果发现它们都属于亚组A，未发现亚组B成员。进一步分析各分离物CP基因的非同义替代／同义替代率，发现该CP基因5′端存在较高的非同义替代，推测该区域的变异是病毒应对不同寄主和环境选择压力的策略。CP基因3′端普遍发生同义替代，编码的氨基酸序列较为保守，因此可以作为抗性研究的重点。

图7 CyMV 3′非编码区茎环结构预测Fig.7 Stem－loop structure prediction of CyMV 3′UTR

CyMV 3′UTR形成的类似三叶草的茎环结构在同属的BaMV已经得到验证，而且CyMV不同分离物间的变异始终都维持着这种结构的稳定性，由此可以推测这种结构对于病毒具有非常重要的作用。但是目前仅仅通过分子结构的热力学稳定性进行模拟，其结构和功能还有待进一步的试验验证。

［1］ 明艳林，李梅，郑国华.建兰花叶病毒研究进展［J］.福建农业学报，2005，20（1）：30－33.

［2］ 王钰丽，李凡，李正跃，等.侵染兰花引起坏死斑症状的病毒种类鉴定［J］.云南农业大学学报，2007，22（2）：222－224.

［3］ 明艳林，郑国华，李梅.建兰花叶病毒厦门分离物的鉴定及其抗血清的制备与应用［J］.植物病理学报，2005，35（4）：366－369.

［4］ Wong S M，Mahtani P H，Lee K C，et al.Cymbidium mosaic potexvirus RNA：complete nucleotide sequence and phylogenetic analysis［J］.Archives Virology，1997，142（2）：383－391.

［5］ Chapman S，Hills G，Watts J，et al.Mutational analysis of the coat protein gene of Potato virus X：effects on virion morphology and viral pathogenicity［J］.Virology，1992，191（1）：223－230.

［6］ 明艳林，郑金龙，郑国华，等.兰花抗病毒基因工程研究进展［J］.亚热带植物科学，2010，39（1）：92－96.

［7］ Chang C，Chen Y C，Hsu Y H，et al.Transgenic resistance to Cymbidium mosaic virus in Dendrobiumexpressing the viral capsid protein gene［J］.Transgenic Research，2005，14（1）：41－46.

［8］ Chia T F，Chan Y S，Chua N H.Characterization of Cymbidium mosaic virus coat protein gene and its expression in transgenic tobacco plants［J］.Plant Molecular Biology，1992，18（6）：1091－1099.

［9］ Lim S H，Ko M K，Lee S J，et al.Cymbidium mosaic virus coat protein gene in antisense confers resistance to transgenic Nicotiana occidentalis［J］.Molecules and Cells，1999，9（6）：603－608.

［10］Tennant P F，Gonsalves C，Ling K S，et al.Differential protection against Papaya ringspot virus isolates in coat protein gene transgenic papaya and classically cross－protected papaya［J］.Phytopathology，1994，84：1359－1366.

［11］Vlugt V D，RenéA A，Goldbach R W.Tobacco plants transformed with the potato virus YNcoat protein gene are protected against different PVY isolates and against aphid－mediated infection［J］.Transgenic Research，1993，2（2）：109－114.

［12］Sherpa A R，Hallan V，Pathak P，et al.Characterization of the coat protein gene of Cymbidium mosaic virus isolates from India［J］.Journal of Phytopathology，2006，154（5）：275－280.

［13］刘长龙，袁世山.单股正链RNA病毒基因组3′非编码区功能［J］.中国动物传染病学报，2010，18（3）：76－81.

［14］Cheng J H，Ding M P，Hsu Y H，et al.The partial purified RNA－dependent RNA polymerases from bamboo mosaic potexvirus and potato virus X infected plants containing the template－dependent activities［J］.Virus Research，2001，80（1－2）：41－52.

［15］Huang C Y，Huang Y L，Meng M，et al.Sequences at the 3′untranslated region of bamboo mosaic potexvirus RNA interact with the viral RNA－dependent RNA polymerase［J］.Journal of Virology，2001，75（6）：2818－2824.

［16］周国辉，陈晓琴，李梅辉，等.广东地区两种兰花病毒病害的分子鉴定及检测［J］.中国病毒学，2004，19（2）：149－152.

［17］Moles M，Delatte H，Farreyrol K，et al.Evidence that Cymbidium mosaic virus （CymMV）isolates divide into two subgroups based on nucleotide diversity of coat protein and replicase genes［J］.Archives of Virology，2007，152（4）：705－715.