甘肃省定西市当归“水烂病”病原鉴定及致病性测定

吕祝邦， 李敏权，2＊， 惠娜娜， 王 立，漆永红， 马永强， 苓 强， 李继平＊

（1.甘肃农业大学草业学院，兰州 730070；2.甘肃省农业科学院，兰州 730070；3.甘肃省农业科学院植物保护研究所，兰州 730070）

当归［Angelica sinensis （Oliv.）Diels］为伞形科植物，药用历史悠久，是中国大宗常用中药材［1］。甘肃当归种植历史悠久，早在西汉初就有记载［2］。随着中药材种植产业结构的调整，甘肃省当归的种植面积近年来逐年增加，2011年全省种植面积达2.60万hm2，其中定西市1.67万hm2，占全省种植面积的64.06%。定西当归质量好、品质佳，2001年定西市岷县被国家命名为“中国当归之乡”，“岷归”远销东南亚、港澳台及欧美等地20多个国家和地区，被欧洲人誉为“中国妇科人参”。

一些学者报道了当归麻口病、褐斑病、软腐病等［3－5］，对病原和致病机理进行了研究。王玉娟［6］等报道了当归“水烂病”，认为细菌和真菌都可引起该病，但目前尚未对致病病原进行系统研究。近年来，由于降水量增多“水烂病”在定西市岷县、漳县、渭源等地严重发生，造成田间早期大量死苗，严重影响当归产业的发展。因此，本试验从病原形态特征、生理生化特性及16SrDNA序列分析入手，对甘肃省当归水烂病病原及其对不同品种当归的致病性进行研究，旨在为深入开展该病害的发生发展规律研究、综合防治以及当归的抗病育种等提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集及镜检

2009－2011年在定西市岷县、漳县、渭源等当归种植区采集水烂病病样，品种为当地主栽品种‘岷归1号’，描述症状并拍照，实验室镜检，发现有溢菌现象。

1.2 供试培养基

NA培养基：酵母浸膏1g，牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，蔗糖10g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。

KB培养基：硫酸镁（MgSO4·7H2O）1.5g，磷酸氢二钾（K2HPO4）1.5g，甘油10g，蛋白胨20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH 7.2。

1.3 病原菌的分离与纯化

在病健交界处剪取病样，3%的次氯酸钠浸泡3min，无菌水冲洗3次，用玻璃棒将组织捣碎静止片刻，在NA平板上划线，28℃下培养48h，挑取单菌落转接纯化并保存备用。

1.4 对烟草致病性测定

将菌落在NA培养基上划线培养36h，刮下菌苔配成菌悬液（浓度3×108cfu／mL），从烟叶背面将菌液注射到6～8叶龄活体烟草的叶肉组织中，室内套袋保湿，以注射灭菌水为对照，观察有无枯斑反应。

1.5 不同品种当归致病性测定

离体接种：选取健壮无损伤的二年生植株，3个品种为：‘岷归1号’（主栽品种）、‘岷归2号’（新繁品种）和‘朝鲜当归 ’（引进品种），每个品种选5株，流水冲洗干净，乙醇表面消毒。参考方中达的注射法接种，在植株根茎交界部位注射菌悬液（浓度3×108cfu／mL），每个品种重复3次，共15株，以接种无菌水为对照。接种后将植株放在培养皿内，置于28℃恒温箱保湿，观察发病情况。

盆栽接种：分别将3个品种的二年生归根冲洗干净，栽于装有灭菌蛭石的育苗盒中，每盒栽2株，待植株长至8～10cm，在根茎交界处用注射法进行接种，每株注射0.5mL菌悬液（浓度3×108cfu／mL），每个品种接3盒，共6株，室内套袋保湿，观察发病情况。

1.6 病原菌形态鉴定

参照方中达的方法，在NA、KB平板上分别划线培养，观察菌落生长速度、菌落形态和产生色素的情况。采用革兰氏染色法染色，在油镜下测量和观察菌体的大小和形状。生理生化指标的测定参考《植 病 研 究 方 法 》［7］、《伯 杰 细 菌 鉴 定 手 册 （第 八版）》［8］、《常见细菌系统鉴定手册》［9］等书中的方法。

1.7 16SrDNA分子鉴定

将菌株在NA培养基上连续活化2～3代，挑取单菌落转接于LB培养基中，28℃、200r／min培养24h。8000r／min离心5min，弃去上清液，加0.85mol NaCl，12000r／min离心5min，弃上清，沉淀用于DNA提取。

基因组DNA提取采用CTAB法［10］。选择细菌16SrDNA通用引物27f和1492r（由上海基康生物公司合成），其序列分别为：5′－AGAGTTTGATCATGGCTCAG－3′和 5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3′。PCR扩增采用50μL反应体系，其中10×PCR Buffer 5μL，25nmol／L MgCl28μL，10nmol／L dNTPs 4μL，10nmol／L 引物27f和引物1492r各1μL，1.5UTaq酶0.5μL，DNA模板2μL，加ddH2O至50μL。PCR扩增条件为：94℃ 预变性4min；然后94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，反应共30个循环；最后72℃延伸10min。4℃ 终止反应，保存备用。PCR产物送上海基康生物技术有限公司进行测序。将测序得到的结果在NCBI上用Blast进行相似性比对分析，用Mega5.1软件对所测基因序列与GenBank中相似性最高的基因序列进行聚类分析，构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 当归水烂病发病症状

在田间，病原菌从当归根茎交界处开始侵染。发病初期，叶柄基部呈现水渍状，植株地上部长势良好，叶片不萎蔫；发病中期，叶柄基部开始腐烂，叶片萎蔫，整个植株呈枯萎状；末期，地上部全部枯死，同时造成地下根腐烂。将分离纯化的菌株定名为ZB1。

2.2 对烟草的致病性

ZB1菌株在烟草叶片上经24～36h显症，产生灰褐色枯斑（图1a），表明该菌株对烟草具有致病性。

2.3 对不同当归品种的致病性

ZB1离体接种试验表明，3个品种都表现不同程度的湿腐。‘岷归2号’（新繁品种）24h显症，接种部位出现明显的水渍状湿腐（图1b），发病率为86.7%；‘岷归1号’（主栽品种）48h左右显症，病组织黑褐色腐烂，发病率为40%；‘朝鲜当归’（引进品种）发病较轻，接种部位出现轻微的水渍状褐斑，发病率为13.3%。

盆栽试验表明，接种5d，‘岷归2号’（新繁品种）开始显症，叶片萎蔫，接种部位有明显的湿腐，7d植株地上部全部枯萎，地下根开始腐烂（图1c）；‘岷归1号’（主栽品种）接种7d开始显症，发病症状跟田间初期症状一样；‘朝鲜当归’（引进品种）接种12d显示轻微的症状。将枯萎的植株进行再次划线分离，得到的菌落和原来的菌落形态一样，符合柯赫氏法则。

图1 ZB1菌株致病性测定Fig.1 Pathogenicity tests of the strain ZB1

2.4 病原菌形态特征和培养性状

菌落在NA培养基上不透明，4～5d菌落略显黄色，中间形成雪花状白色小点且向内凹陷。在KB培养基上生长快，菌落透明，产生可扩散性黄绿色荧光色素。菌体杆状，大小（0.7～0.8）μm×（2.3～2.8）μm，革兰氏染色阴性（图2）。

图2 菌株ZB1形态特征及革兰氏染色结果Fig.2 Morphological characteristics and Gram－staining of the strain ZB1

2.5 生理生化特性

该菌最适生长温度为25～30℃，具有运动性，不耐盐，能溶解于3%的KOH溶液，紫外灯下产生黄绿色荧光，严格好氧，水解淀粉，硝酸盐还原阴性，接触酶反应阳性，可利用葡萄糖、麦芽糖、肌醇、D－甘露糖、甘油等碳素化合物，不能利用L－山梨糖。以上测试项均符合荧光假单胞杆菌的生理生化特性。

2.6 16SrDNA序列测定及同源性比较

对菌株的16SrDNA进行测序，得到的片段大小为1445bp。测序后，将菌株的16SrDNA区域序列与GenBank（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov）数据库进行Nucleotide Blast序列比对，结果表明，该菌株与GenBank已报道的荧光假单胞杆菌［Pseudomonas fluorescens（Trer.）Migula］AF336352.1序列相似性达99%。

用Clustal X软件对所测的菌株序列进行校正，将GenBank上获得的数据载入Mega5.1软件，按照N－J法，构建系统发育树。从构建的发育树可以看出，ZB1菌株与假单胞杆菌属的菌株相似性较高，和荧光假单胞杆菌（P.fluorescens）在同一分支，聚为一类（图3）。结合16SrDNA分子生物学特性及致病性特点，将菌株定为荧光假单胞杆菌第2生物型（P.fluorescens生物型Ⅱ）。

图3 菌株ZB1的16SrDNA序列聚类分析树Fig.3 Cladogram of the strain ZB1based on 16SrDNA sequences

3 讨论

当归“水烂病”在1990年就有学者提出，其症状与其他当归病害有所不同，本文首次对引起该病害的病原进行报道，在病组织中只分离到了细菌没有发现真菌。细菌病原的鉴定是细菌病害研究的基础，明确病害的病原是制定有效防治措施的重要前提。细菌分类鉴定除传统的形态特征、培养特性、生理生化特征和免疫学反应等方法外，16SrDNA技术已被用于细菌的快速分子诊断和分类鉴定。国内外一些学者利用16SrDNA方法对一些细菌进行了研究，刘长远［11］等采用16SrDNA方法鉴定出了黄瓜细菌性白枯病病原为绿黄假单胞菌（P.viridiflava）。李守萍［12］等利用16SrDNA鉴定出油松内菌根促生细菌为荧光假单胞杆菌（P.fluorescens），彭帅［13］等通过16SrDNA序列分析鉴定出了产葡萄糖酸的荧光假单胞杆菌（P.fluorescens），邓刚［14］等采用16SrDNA鉴定了甘肃番茄细菌性斑点病病原为丁香假单胞杆菌番茄致病变种（P.syringae pv.tomato）。本试验通过形态学、生理生化特性和16SrDNA分子特征鉴定出了甘肃省当归水烂病病原为荧光假单胞杆菌 （P.fluorescens）。根据国内外一些学者的报道，荧光假单胞杆菌是一类广泛分布于植物根际的促生细菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR），分泌的各种次生代谢产物能防治一些植物病害［15－17］，如小麦全蚀病［Gaeuman－nomyces graminis （Sacc.）Arx et Olivier］、马铃薯软腐病（Erwinia carotovora）、番茄灰霉病（Botrytis cinerea Pers.ex Tr.）等。根据资料的报道，荧光假单胞杆菌5个生物型中植物病原菌只有生物Ⅱ型［8，18］。5个生物型的分子鉴定比较复杂，本文对该病原菌只进行了16SrDNA测序分析，其他分子生物学特性尚待进行更深入的研究，暂时将该病原菌定为荧光假单胞杆菌第2生物型（P.fluorescens生物型Ⅱ）。本文首次报道了荧光假单胞杆菌第2生物型能引起当归水烂病，当归是该病原菌的一个新寄主。

致病性测定结果表明，该菌株对3个当归品种均致病，但对不同品种致病力不同，其中对‘岷归2号’（新繁品种）致病力最强，‘岷归1号’（主栽品种）次之，对‘朝鲜当归’（引进品种）致病力最弱，说明当归的不同品种可能存在抗性分化。从病害控制的角度考虑，新品种‘岷归2号’的推广应当慎重。

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