可视化核酸试纸条法快速检测松材线虫

张裕君， 王金成， 魏亚东

（天津出入境检验检疫局，天津 300461）

松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）属重要的检疫性有害生物，引起的松材线虫病是世界上最具危险性的森林病害［1－2］。该病已在多个国家发生和流行，且呈扩散蔓延趋势。我国自1982年首次在南京市发现松材线虫病，目前已蔓延扩散到广东、江苏、浙江、安徽、山东等省，对我国林业造成了严重破坏，对松林的安全构成了严重威胁。检疫是防止该病远距离传播最有效的方式，而简单、快速、准确、灵敏的检测技术是实施有效检疫的强力手段，因此针对松材线虫的检测技术研究具有重要意义。

松材线虫的检测方法主要有形态学检测、生化检测和分子生物学检测三大类［3］，形态学对经验的要求比较高，而且存在幼虫鉴定困难等等问题，生化检测相对用得较少，松材线虫的分子检测技术主要有特异 性 引 物 PCR 法［4－5］、ITS－PCR－RFLP 法［6］和实时 荧 光 定 量 PCR 法［7－9］（quantitative real－time PCR，qPCR）。这些方法具有高效、快速、低污染等优点，但是特异性引物PCR法、ITS－PCR－RFLP法需要电泳、染色、成像等多个步骤，而实时荧光定量PCR法所使用的仪器设备投入大、标记探针、试剂成本高，限制了该方法的推广［10］。

胶体金免疫层析法（gold immunochromagraphy assay）是20世纪80年代末发展起来的一种快速的免疫学测定方法［11］，它是胶体金标记技术和免疫层析技术相结合的产物，基本原理是利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用，使抗原抗体发生反应，在检测线位置，阳性反应在试纸条上出现红色条带，阴性反应不显色。通过核酸引物两端修饰相应标记物（如生物素、荧光素），同时试纸条上相应位置标记对应抗体，就可以实现核酸产物的试纸条检测。核酸试纸条技术已经在结核分枝杆菌 甲型H1N1病毒［13－14］、外源 基 因 EPSPS 的 检 测［15］等 方 面 都 有 了成功应用的报道，本研究在特异性引物PCR方法的基础上，结合核酸试纸条检测技术，建立一种简单、快速、准确、灵敏的可视化松材线虫分子检测技术。

1 材料与方法

1.1 供试材料及试剂

本试验测试了近年来天津出入境检验检疫局植物检疫实验室截获的来源于国外的8个线虫种群和4个来自我国江苏的线虫种群，并经过了形态及测序验证，其中包括4个拟松材线虫种群，3个伞滑刃线虫种群，1个真滑刃属线虫种群，4个松材线虫种群。同时测定了2种植物材料和2种真菌材料（表1）。

表1 供试样本的种类及来源Table 1 Isolates and origins of samples used in this study

主要试剂为 TIANamp Genomic DNA Kit（购自TIANGEN 公 司）；Ex Taq 酶 试 剂、DL2000DNA Marker（购自TaKaRa公司）；通用型核酸扩增物快速检测试纸条（购自杭州优思达生物技术有限公司）。

试验主要仪器为PCR仪（PTC－200DNA Engine）；电泳仪（Bio－RAD）；紫外凝胶成像系统（Infinity－3026）。

1.2 线虫基因组DNA提取及PCR扩增

1.2.1 线虫基因组DNA提取

将适量线虫放入1.5mL离心管，稍离心，预冷后加入适量液氮，用研棒研磨至粉末状，然后依次加入缓冲液GA、蛋白酶K、缓冲液GB，70℃水浴放置10min，加入乙醇振荡，混合液加入吸附柱CB3后离心，漂洗2次，晾干吸附柱，在吸附膜滴加50μL TE，离心后得到线虫基因在DNA，－20℃保存备用。

1.2.2 PCR引物设计

根据截获的松材线虫测序所得的ITS DNA序列，并通过NCBI比对分析，利用引物设计软件Oligo 6.0设计一对针对松材线虫的特异性引物及下游引物的竞争引物，片段大小为197bp，上、下游引物的5′端分别修饰有生物素（biotin）和荧光素（FITC），由Invitrogen公司合成。

上 游 引 物：Bx－F3－bio 5′－TCTGCACGTTGTGACAGTC－3′；下 游 引 物：Bx－B3－fit 5′－TCATCCGAACGTCCCTGAC－3′；竞 争 引 物：Bx－B3－comp 5′－GTCAGGGACGTTCGGAACT－3′；相 关 引 物 序列已申请发明专利（专利申请号：20120231555.8）。

1.3 松材线虫基因组DNA引物特异性试验

试验以灭菌超纯水作为空白对照，分别以Bm－Js1、BmJs2、BmSk1、BmSk2、BdSk1、BFSk1、BrSk1、Auk线虫种群和2种植物、2种真菌样本作为阴性对照，以BxUs1、BxUs2、BxJs1、BxJs2等松材线虫作为阳性对照，应用松材线虫特异引物对（Bx－F3－bio、Bx－B3－fit）进行PCR扩增。

PCR反应体系：10×Ex Taq Buffer 2.5μL，dNTP（2.5mmol／L）1μL，上、下游引物（10μmol／L）各0.5μL，模板DNA 1μL，Ex Taq酶（5U／μL）0.25μL，ddH2O 19.25μL，总体积25μL，随后进行PCR扩增。PCR反应条件：94℃ 预变性2min，1个循环；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min。取10μL PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统上观察并记录结果。

1.4 PCR产物试纸条检测试验

取5μL扩增产物滴加在试纸条的样品垫上，同时滴加2～3滴缓冲液，10min后观察质控线、检测线，判读出阴、阳性的结果。

1.5 PCR扩增中竞争引物最适比例的筛选

试验将上、下游引物与竞争引物（Bx－F3－bio：Bx－B3－fit：Bx－B3－comp）的比例分别按 A（0.5∶0.5∶1）、B（0.5∶0.5∶2）、C（0.5∶0.5∶3）、D（0.5∶0.5∶4）、E（0.5∶0.5∶5）分为5组，每组PCR反应以灭菌超纯水模板作为空白对照，以松材线虫基因组DNA为阳性对照。

PCR反应体系：10×Ex Taq Buffer 2.5μL，dNTP（2.5mmol／L）1μL，上、下游引物（10μmol／L）各0.5μL，竞争引物（10μmol／L）分别加1、2、3、4、5μL，模板DNA 1μL，Ex Taq 酶（5U／μL）0.25μL，ddH2O补足至体积25μL，随后进行PCR扩增。PCR反应条件同1.3，扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳和试纸条检测。

1.6 PCR扩增产物两种检测方法的灵敏度测试

将松材线虫阳性对照PCR扩增产物分别用灭菌ddH2O稀释1、2、10、20、100、200、1000倍，每个稀释梯度各取稀释后产物5μL进行琼脂糖凝胶电泳及试纸条检测，分别在凝胶成像系统、试纸条上观察并记录结果。

2 结果及分析

2.1 松材线虫基因组DNA引物特异性试验

分别提取表1中所列松材线虫基因组DNA，应用松材线虫特异引物对 Bx－F3－bio、Bx－B3－fit进行PCR扩增、凝胶电泳检测，结果如图1所示，只有第14、15、16和17泳道分别是松材线虫 BxUs1、Bx－Us2、BxJs1和BxJs2基因组DNA扩增出片段大小197bp的条带，与预期结果一致，同时，空白对照、两种植物、两种真菌及8种线虫种群阴性对照样本均无扩增产物，说明引物对Bx－F3－bio、Bx－B3－fit具有良好的特异性。

图1 松材线虫特异引物PCR扩增产物电泳图Fig.1 Gel electrophoresis of PCR products with specific primers for B.xylophilus

2.2 PCR扩增中竞争引物比例的筛选

上、下游引物与竞争引物的比例、扩增体系见材料与方法1.5，每组不同比例引物以水为空白对照、松材线虫BxUs1为阳性对照模板进行扩增，产物分别用电泳及试纸条检测，从图2A凝胶电泳结果可以看出，空白对照（A－a1、A－b1、A－c1、A－d1和 A－e1）未见扩增产物，说明加入竞争引物对松材线虫扩增特异性没有影响，但随着竞争引物所占比例逐渐升高，电泳特异性条带的亮度逐渐减弱（图2中A－a2、A－b2、A－c2、A－d2和 A－e2），说明随着竞争引物浓度上升，PCR扩增产物的量逐渐减少；从图2－B试纸条检测结果可以看出，在竞争引物比例等于或低于0.5∶0.5∶3时，空白对照会出现假阳性结果（图2中B－a1、B－b1、B－c1），随着竞争引物比例达到或大于0.5∶0.5∶4时候，空白对照中假阳性结果随即消失（图2中B－d1、B－e1），同时对阳性对照的条带清晰度无影响（图2中B－d2、B－e2），综合以上分析，确认上、下游引物与竞争引物的比例为 D组（0.5∶0.5∶4），在消除试纸条试验假阳性结果的同时保证扩增产物的量，因此将其作为最适筛选比例，进行后续试验。

图2 不同竞争引物比例的松材线虫特异引物PCR扩增产物电泳图和试纸条图Fig.2 Gel electrophoresis and nucleic acid strip assay of PCR products amplified with different proportions of the competitive primer to the specific primers for B.xylophilus

2.3 PCR扩增产物两种检测方法的特异性测试

用材料与方法1.5中D组（上游引物、下游引物、竞争性物比例为0.5∶0.5∶4）进行PCR扩增，以水为空白对照、以Zm1、Lb1两种植物、Ag1、Fg1两种真菌、BmJs1BmJs2BmSk1BmSk2BdSk1BFSk1、BrSk1、Auk等8种线虫种群为阴性对照，以及BxUs1、BxUs2、BxJs1、BxJs2等松材线虫为阳性对照，取扩增产物进行试纸条检测（图3），从检测结果可以看出，只有松材线虫阳性对照扩增产物出现特异性红色条带，其余空白对照及其他各阴性对照在检测线位置均无条带出现，显示了该检测方法良好的特异性。

图3 松材线虫试纸条检测方法特异性检测Fig.3 The specificity of nucleic acid strip assay of B.xylophilus

2.4 PCR扩增产物两种检测方法的灵敏度测试

用凝胶电泳检测时，PCR扩增产物10倍时，用肉眼难以看见清晰的特异性条带（图4A），当扩增产物稀释随着松材线虫PCR扩增产物浓度的降低，特异性条带的亮度也逐渐下降；而试纸条检测法中（图4B），同样稀释梯度，同样上样量的情况下，当松材线虫PCR扩增产物稀释1000倍后，仅凭肉眼仍能观察到清晰的阳性检测线，因此核酸试纸条检测的灵敏性要远远高于普通凝胶电泳检测法。

图4 凝胶电泳检测法和试纸条法检测灵敏度比较Fig.4 Sensitivity comparison of gel electrophoresis and NADA

3 讨论

本研究通过将聚合酶链式反应（PCR）与核酸试纸条检测方法相结合，首次建立了一种核酸试纸条可视化检测松材线虫的方法，无需凝胶电泳检测PCR扩增产物所需要的制胶、电泳、成像等步骤，将2h的检测时间缩短为10min，大大提高了检测效率，灵敏度试验结果表明核酸试纸条法的检测灵敏度比传统电泳凝胶成像高50倍以上，同时该方法检测完后只产生少量的纸质垃圾，处理简单，对环境友好，而凝胶电泳法检测结束后，产生染色凝胶及塑料手套，处理困难，后期处理成本也高。

用凝胶电泳法检测PCR扩增产物时，出现引物间二聚体（cross dimers，CDs）对扩增结果的检测不会发生影响，但是应用核酸试纸条法时，如果不消除两侧同时带有标记物的引物二聚体，就会不可避免地出现假阳性结果，对检测结果产生影响［16－17］，而特异引物的区段是特定的序列，通过改变引物本身消除引物二聚体存在一定的局限性，本研究在PCR反应体系中加入一定比例的竞争引物（competitive oligonucleotide primer，COP），用于防止带标记的上、下游引物间形成引物二聚体，从而消除带标记引物二聚体的形成，可以很好地消除假阳性对试验结果的影响。

本研究中应用的可视化试纸条检测方法与松材线虫已有的普通PCR电泳法、ITS－PCR－RFLP法和实时荧光PCR技术相比，仪器、成本大大降低，检测时间上耗时更短，提高了出入境口岸松材线虫的鉴定工作效率，能更好地适应进出口贸易快速通关的要求，所使用的PCR产物检测试纸条是个通用型试纸条，可以广泛应用于PCR诊断试剂的开发，该检测方法无需电泳仪、凝胶成像仪等仪器设备投入，应用成本低，对于PCR检测方法在基层实验室的推广应用将有着巨大的推动作用。

可视化快速核酸试纸条法具有操作便利、特异性强、灵敏度高，结果直观、稳定、可靠、对环境友好等多项优点，适合口岸检疫实验室进行松材线虫的快速筛查。

［1］ 祝列克.要重视和防范外来有害生物的入侵危害［J］.中国森林病虫，2002，21（6）：36－39.

［2］ Xie Bingyan，Cheng Xinyue，Shi Juan，et al.Mechanisms of invasive population establishment and spread of pinewood nematodes in China［J］.Science in China Series C：Life Sciences，2009，52（6）：587－594.

［3］ 刘源岗，龙瑞敏.松材线虫的快速检测［J］.安徽农业科学，2007，35（28）：8926－8928.

［4］ 赵立荣，廖金铃，钟国强.松材线虫和拟松材线虫的PCR快速检测［J］.华南农业大学学报，2005，26（2）：59－61.

［5］ 陈凤毛，叶建仁，吴小芹.应用特异引物组合检测松材线虫［J］.林业科技开发，2006，20（3）：14－16.

［6］ Chen Fengmao，Ye Jianren，Tang Jian，et al.Discrimination of Bursaphelenchus xylophilus and Bursaphelenchus mucronatus by PCR－RFLP technique［J］.Frontiers of Forestry in Chi－ｉｎａ，２００７，２（１）：８２－８６.

［7］ 葛建军，曹爱新，刘先宝，等.应用TaqMan－MGB探针进行松材线虫的实时荧光定量检测技术研究［J］.植物病理学报，2005，35（6）：52－58.

［8］ 郭立新，段维军，顾建锋，等.木质包装中松材线虫的实时荧光PCR检测［J］.植物检疫，2011，37（5）：129－134.

［9］ Cao A X，Liu X Z，Zhu S F，et al.Detection of the pinewood nematode，Bursaphelenchus xylophilus，using a real－time polymerase chain reaction assay［J］.Phytopathology，2005，95（5）：566－571.

［10］王焱，季镭，余本渊，等.3种松材线虫分子检测技术的比较分析［J］.南 京 林 业 大 学 学 报 （自 然 科 学 版），2007，31（4）：128－132.

［11］Brada D，Roth J.“Golden blot”—detection of polyclonal and monoclonal antibodies bound to antigens on nitrocellulose by protein A－gold complexes［J］.Analytical Biochemistry，1984，142（1）：79－83.

［12］Rendong Fang，Xia Li，Lin Hu，et al.Cross－priming amplification for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens［J］.Journal of Clinical Microbiology，2009，47（3）：845－847.

［13］Wu L T，Curran M D，Ellis J S，et al.Nucleic acid dipstick test for molecular diagnosis of pandemic H1N1［J］.Journal of Clinical Microbiology，2010，48（10）：3608－3613.

［14］张永乐，厉小玉，潘克女，等.甲型H1N1流感病毒快速诊断核酸试纸条的研制及应用［J］.中华医院感染学杂志，2011，21（14）：2871－2873.

［15］汪琳，罗英，周琦，等.柏亚铎核酸试纸条在检测转EPSPS基因作物中的应用［J］.生物技术通讯，2011，22（2）：238－242.

［16］潘克女，张永乐，张辉.核酸试纸条法检测HBV基因型方法的建立［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2010（8）：768－770.

［17］杨贤，黄欢，殷竹君，等.高灵敏可视化核酸试纸条法快速检测HBV DNA［J］.现代生物医学进展，2011，11（7）：1277－1281.