一株基因Ⅶb亚型新城疫病毒F和HN基因的序列分析

孙敏华，董嘉文，李林林，袁建丰，胡奇林

(广东省农业科学院兽医研究所广东省公共卫生公共实验室禽病研究室，广东广州510640)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的，一种严重危害养禽业的急性高度接触性传染病[1]。NDV为副粘病毒科副粘病毒亚科禽腮腺炎病毒属成员[2]。其基因组为单股负链不分节段RNA，长约15.2kb[1]，至少编码6种蛋白，分别为NP、P、M、F、HN和L蛋白。F蛋白(融合蛋白)和HN蛋白(血凝素神经氨酸酶蛋白)是病毒的主要免疫原性蛋白，可以诱导机体产生中和抗体。F蛋白介导病毒与宿主细胞的膜融合，其裂解位点序列与病毒毒力有关[1,3]，HN蛋白具有吸附、神经氨酸酶及促进融合等作用，此外还可能与病毒毒力有关[4]。

尽管NDV只有一个血清型，但其包含两个Class，其中Class I包含9个基因型，而Class II包含的基因型多达10个。目前我国主要流行Class II中的基因Ⅶ型，其中以Ⅶd亚型多见，尽管基因Ⅶa、Ⅶc、Ⅶd、Ⅶe、Ⅶf亚型均见报道[5]，但基因Ⅶb亚型分离株尚未见报道。本研究从佛山三水发病鹅病料中分离鉴定出一株NDV，经序列分析表明其为基因Ⅶb亚型。因此，本研究主要对该病毒株的F和HN蛋白进行分析，了解其主要免疫原性蛋白的变化情况，为ND的防制提供参考。

1 材料和方法

1.1 SPF鸡胚 9日龄～11日龄SPF鸡胚由广东永顺生物制药有限公司提供。

1.2 主要试剂 NDV标准抗原及标准阳性血清购自中国兽医药品监察所；引物由Invitrogen公司合成；Ex Taq DNA聚合酶、DNA分子量标准、pMD18-T载体、胶回收试剂盒购自TaKaRa公司；TRIzol试剂、M-MuLV购自Invitrogen公司；DH5α感受态购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 病毒的分离鉴定 采集2010年佛山市三水区某养鹅场疑似ND发病鹅的心脏、肝脏、脾脏、肾脏等组织，并进行病毒分离[6]，收获死亡鸡胚尿囊液，按ND诊断技术的国家标准进行HA和HI试验[7]。

1.4 引物的设计及F和HN基因的扩增 参照文献[6]设计并合成引物，进行PCR扩增、克隆，阳性菌液由Invitrogen公司进行序列测定。

1.5 F和HN基因核苷酸进化树绘制及序列分析从GenBank下载44株NDV F基因ORF的前374nt序列及21株NDV HN基因的ORF序列，利用DNAStar 6.0软件包将它们与本次分离株的F和HN基因一起进行序列分析。使用MegAlign中的Clustal V方法，在F基因核苷酸水平上绘制系统进化树。

2 结果与讨论

2.1 病毒的鉴定及分子特征 病料接种SPF鸡胚后，所有鸡胚72h内死亡。HA和HI试验结果显示，所收获的尿囊液具有血凝活性，并且能够被NDV标准阳性血清完全抑制。经F和HN基因扩增、序列测定和分析表明，该分离株F蛋白裂解位点序列为112RRQKRF117，符合强毒株裂解位点特征；HN蛋白由571个氨基酸残基组成，也符合强毒株的分子特征。从F和HN蛋白序列的分子特征综合判断，Goose/Foshan/2010株为强毒株。

2.2 F和HN基因系统进化树及序列相似性分析参考文献[5]和[6]，利用Mega 4.0软件绘制F基因ORF前374nt序列的进化树，并将44株NDV划分为9个基因型(图1)。进化分析显示，本次所分离的病毒株属于基因Ⅶb亚型。经核苷酸及推导氨基酸序列相似性比较后显示，Goose/Foshan/2010株与基因Ⅰ型(Queensland V4)、Ⅱ型(B1、La Sota)、Ⅲ型(Mukteswar)疫苗株之间F基因核苷酸的相似性分别为82.6%、79.9%和81.6%，氨基酸的相似性分别为83.1%、77.4%和79.8%。这表明，与疫苗株相比，基因Ⅶb亚型病毒株已经存在一定变异。Goose/Foshan/2010株与基因Ⅶb亚型病毒株间核苷酸及氨基酸相似性均高于90.4%，其中与秘鲁分离株APECK92173(AV 1474/922)，马来西亚分离株BMYBU87078(AV 1094/90144)、MB076/05之间核苷酸和氨基酸序列相似性最高，分别为93.3%～95.5%和93.5%～97.6%，表明Goose/Foshan/2010株可能与它们具有共同来源。尽管周边国家(如哈萨克斯坦、日本)曾发现过基因Ⅶb亚型病毒株，但这些病毒株与欧洲流行株关系密切，而Goose/Foshan/2010株与秘鲁及东南亚基因Ⅶb亚型病毒株关系密切。流行情况及进化关系表明，我国首次分离的基因Ⅶb亚型病毒株Goose/Foshan/2010株极可能来自东南亚。相对而言，Goose/Foshan/2010株与基因Ⅶa、Ⅶc、Ⅶd、Ⅶe亚型病毒株核苷酸及氨基酸相似性略低，分别为88.0%～92.8%、89.5%～96.0%；它与我国标准强毒F48E9株间核苷酸及氨基酸相似性分别为84.8%、92.2%。由此，同一基因型中的分离株序列相似性较高，而进化关系较远的分离株间则较低。尽管此前有报道表明个别NDV分离株出现了重组现象[8]，并推荐利用F和HN基因序列同时分析。本研究用Goose/Foshan/2010株F和HN基因及其推导氨基酸序列绘制的系统进化树极其相似，并且它们与F基因ORF前374nt所绘制的系统进化树并无明显差异。

2.3 F蛋白和HN蛋白的变异 F和HN蛋白是病毒的两个主要免疫原性蛋白。Goose/Foshan/2010株F蛋白上的6个潜在的糖基化位点、12个半胱氨酸残基、7个中和位点均高度保守，表明其F蛋白并未发生大的变异。HN蛋白中也有6个潜在的糖基化位点，Goose/Foshan/2010株缺失了538位～540位的潜在糖基化位点。尽管该位点不被糖基化，但分析表明，基因Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型和Ⅸ型病毒株多存在此位点，而基因Ⅴ型、Ⅵ型、Ⅶ型则多缺失该位点。此外，HN蛋白发生E347D和K495E两个点突变。经分析表明，基因Ⅶ型病毒株第347位抗原位点变异无明显规律，而第495位抗原位点除基因Ⅰ型、Ⅲ型、和Ⅸ型为K，基因Ⅳ型为G，基因Ⅱ型弱病毒株为V外，其余基因型病毒株多为E。HN蛋白第347和495位抗原位点极其重要，可能是不同病毒株抗原性差异的原因之一[9]。这表明Goose/Foshan/2010株的HN蛋白可能与疫苗株的抗原性存在一定差异。

目前，基因Ⅶ型病毒株在我国广泛流行，并以基因Ⅶd亚型为主，基因Ⅶb亚型病毒株尚未见报道。本研究从广东地区首次分离鉴定出一株鹅源基因Ⅶb亚型NDV，丰富了病毒的流行病学资料。由于鸡、鸭、鹅、鸽甚至野鸟群中广泛存在基因Ⅶ型病毒株，新基因型的出现使得我国ND的流行情况更加复杂。因此，对ND的不断监测，做好综合防控措施将有利于防制该病。

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[4]Huang Zhu-hui,Panda A.The hemagglutinin-neuram inidase protein of Newcastle disease virus determ ines tropism and virulence[J].JVirol,2004,78(8):4176-4184.

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[6]孙敏华，吕殿红，董嘉文，等.一株鸽源新城疫病毒主要毒力基因分析[J].广东畜牧兽医科技，2010，35(5)：30-34.

[7]刘华雷，吴艳涛，王志亮，等.中华人民共和国国家标准.新城疫诊断技术[S].GB/T 16550-2008.

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