鸭疫里氏杆菌吉林分离株camp基因的克隆、表达及间接ELISA检测方法的建立

么乃全，高云航*，于 丹，张 敏，耿 磊，王全凯*

(1.吉林农业大学动物科技学院，吉林长春130118；2.长春市动物疫病预防控制中心，吉林长春130061；3.中国兽医药品监察所，北京100081)

鸭疫里氏杆菌病是目前影响养鸭业最为严重的细菌性传染病，在世界各养鸭地区几乎均有流行，尤其在鸭饲养密度高的东南亚地区，发病情况尤为严重[1]。控制该病最有效的措施是全菌体灭活油佐剂疫苗免疫预防，对同血清型菌攻毒保护率可达100%[2]。但因其病原鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)血清型众多及血清型间缺乏交叉保护，限制了灭活油佐剂苗的应用，因此开发RA的亚单位疫苗成为解决此问题的关键。Camp是一种唾液酸糖蛋白，具有促进溶血素溶血功能的作用，已被初步证明是RA可能的毒力因子，并且在各血清型菌间具有很高的同源性和保守性，在部分血清型菌株间具有反应原性[3]。为评价该蛋白用于亚单位疫苗开发及诊断的潜在价值，本研究以吉林奥白星鸭分离鉴定的JL-1RA的DNA为模板，克隆camp基因并进行原核表达，利用western blot进一步验证该Camp是众多血清型RA菌株共有的具有良好反应原性和免疫原性蛋白；同时以Camp表达蛋白为包被抗原建立间接ELISA检测方法，为鸭RA的流行病学调查、亚单位疫苗的开发提供有效的方法和实验依据。

1 材料和方法

1.1 菌株、质粒及血清 血清1型鸭RA分离自吉林某鸭场的法国奥白星鸭，命名为JL-1；血清1、2、11型RA由南京农业大学张炜博士惠赠，血清10、17型RA由北京农业大学苏敬良副教授惠赠；E.coli DH5α、BL21(DE3)感受态和 pET-28a、pMD18-T载体均由吉林农业大学传染病实验室保存；兔抗血清1、2、10、11、17型RA全菌体阳性血清、鸭抗RA(JL-1)阳性血清、鸭E.coli、沙门氏菌(Saimonella)、巴氏杆菌(Pasteurellosis)和鸭肝炎病毒(DHV)阳性血清由本实验室制备；待检血清采自吉林某鸭场；SPF鸭血清购自哈尔滨兽医研究所。

1.2 主要试剂 HRP标记羊抗兔、鸭HRP-IgG、DAB显色剂购自北京鼎国生物技术有限责任公司；Ex Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、dNTP M ixture、Bam HⅠ及XhoⅠ、蛋白质Marker和DNA Marker购自TaKaRa公司；凝胶DNA回收、质粒小提试剂盒购自索莱宝生物科技有限公司。

1.3 引物的设计与合成 根据GenBank中登录的camp基因(AF202727)序列使用Primer 5.0设计一对引物，上游引物P1：5'-GCGGATCCATGAAACAAT CTATT-3'(Bam HⅠ)，下游引物 P2：5'-CGCTCGAG TTACTTTACATTTA-3'(XhoⅠ)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 camp基因的克隆及pET-camp重组质粒的构建 以JL-1株RA基因组DNA为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。目的条带经凝胶DNA回收试剂盒纯化回收后克隆于pMD18-T载体中，并通过Bam HⅠ和XhoⅠ进行双酶切亚克隆于pET-28a中构建重组表达质粒pET-camp，将其转化于E.coli BL21中，由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序鉴定。

1.5 Cam p重组蛋白的诱导表达及纯化 采用终浓度为1mmol/L的IPTG对含有阳性重组质粒和空载体质粒的E.coli BL21诱导表达5h，诱导后菌体经超声裂解收集包涵体，经处理后进行SDS-PAGE电泳检测，观察Camp蛋白表达情况。诱导表达的蛋白用电洗脱方法进行纯化，SDS-PAGE电泳检测纯化效果，同时测定纯化蛋白浓度。

1.6 Camp表达蛋白的western blot鉴定 纯化的Camp蛋白进行SDS-PAGE电泳，采用湿转法将表达蛋白从凝胶中转印至PVDF膜上，10%脱脂奶粉4℃封闭过夜，分别加入兔抗血清1、2、10、11、17型RA阳性血清，37℃孵育1h，以羊抗兔HRP-IgG于37℃孵育1h，DAB显色剂显色。

1.7 间接ELISA方法的建立

1.7.1ELISA反应体系确立将纯化的Camp表达蛋白用0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释不同浓度包被酶标板，将鸭抗RA(JL-1)阳性、阴性血清倍比稀释进行双方阵试验，同时对酶标二抗的稀释度进行优化，筛选出最佳的抗原包被浓度、血清稀释度及酶标抗体工作浓度，确定最终的ELSIA反应体系。同时参照文献[4]的方法，以RA菌体超声破碎抗原包被酶标板建立间接ELISA。

1.7.2ELISA临界值的确定用建立的ELISA方法对经试管凝集检测为阴性的50份血清进行检测，计算出阴性血清平均OD490nm值()和标准差(SD)，计算公式为+3SD，得出结果即为判定血清阴、阳性的临界值。

1.7.3间接ELISA方法的特异性检验利用建立的ELSIA 方法对鸭 E.coli、Saimonella、Pasteurellosis、DHV、RA的阳性血清进行检测，测得各自OD490nm值根据临界值判定阴、阳性，以检验ELISA方法的特异性。

1.7.4间接ELISA方法重复性检验使用同一批制备的表达抗原对筛选的阳性和阴性血清样本进行检测，每个样品设6个重复，分别进行板内和板间重复性试验，测得结果经SPSS 17.0软件分析计算板内和板间的变异系数(CV)，以检验ELISA方法的重复性。

1.7.5间接ELISA方法临床应用及对比试验利用建立的Camp-ELSIA及RA菌体超声破碎ELISA方法分别检测吉林省部分鸭场采集的240份鸭血清样本及12份SPF鸭血清样本，根据临界值判定结果，统计两种方法检测血清样本的阳性率，比较两种方法符合率。2、10、11和17型RA全菌体阳性血清均发生特异性反应。

2 结果

2.1 camp基因的克隆及pET-camp重组质粒构建应用设计的引物以RA(JL-1)基因组DNA为模板扩增出约1000bp的目的基因片段(图1)，与预期大小相符(1026bp)。构建的pET-camp原核表达质粒经Bam HⅠ、XhoⅠ双酶切和PCR鉴定，均可见与目的基因大小一致片段，经测序表明重组质粒构建正确，并且目的基因与GenBank中登录的几株RA的camp基因序列同源性达到99%。

2.2 Cam p重组蛋白表达、纯化及western blot分析 pET-camp重组质粒转入E.coli BL21中经IPTG诱导5h后进行SDS-PAGE电泳检测，在约37ku处可见一条清晰蛋白条带(图2)，与预期结果一致，表明正确表达出包涵体形式的Camp蛋白。以电洗脱方法纯化目的蛋白，经测定蛋白浓度为2.5mg/m L。同时western blot分析显示Camp蛋白与兔抗血清1、

2.3 间接ELISA方法建立

2.3.1ELISA最佳反应体系及临界值确定如表1所示，经双方阵试验确定Camp表达蛋白的最佳包被浓度为10μg/m L，血清最佳稀释度为1∶100，尽管血清稀释度1∶50时阳性血清OD490nm值最高，但阴性血清OD490nm也相对偏高。在固定抗原包被浓度和血清稀释倍数后确定酶标抗体工作浓度为1∶2000时阳性血清OD490nm最高，并且与阴性血清OD490nm差值最大。计算所检测50份阴性血清OD490nm的平均值(X)和标准差(SD)分别为0.236和0.0452，经公式计算为0.372，为所建立ELISA的临界值。

表1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数确定Table 1Result of optimal antigen coating concentration and serum dilution

2.3.2特异性试验通过对鸭E.coli、Saimonella、Pasteurellosis、DHV、RA的阳性血清进行检测，除RA为阳性外，其它几种病原阳性血清OD490nm值均小于0.372(表2)，表明Camp蛋白与上述几种血清不发生交叉反应。

2.3.3重复性试验ELISA重复性检测结果经SPSS软件统计分析，表明板内和板间重复性检测的变异系数均小于6%(表3)，表明所建立的ELISA检测方法具有良好的重复性。

表2 特异性试验结果Table 2Result of specificity test

2.3.4临床检测及对比试验对吉林省部分鸭场采集240份鸭血清及12份SPF鸭血清样本进行检测，12份SPF鸭血清样本均为阴性结果。240份鸭血清检测结果如表4所示，Camp表达蛋白ELISA检测血清抗体阳性86份，阳性率35.8%，RA菌体超声破碎抗原ELISA检测血清抗体阳性126份，阳性率52.5%。两种方法的符合率为77.5%。

表4 比对试验结果Table 4Result of comparison test

3 讨 论

当前控制鸭RA感染主要办法是用灭活油佐剂苗进行免疫。郭宇飞、谢永平及胡清海等均研制了鸭RA多价灭活疫苗，对同血清型菌攻击有较好的免疫保护效果[5-7]。但鸭RA血清型较多并且缺乏交叉保护使灭活苗的应用有很大局限性。因此，开发RA基因工程亚单位疫苗是目前研究的重点。Crasta等研究表明RA中存在一种唾液酸糖蛋白(Camp因子)，与链球菌Camp因子具有相似的促进溶血素溶血功能，推测是RA的毒力因子，western blot还证明Camp蛋白能够与血清1、2、3、5、6、13、14、19型菌株Camp表达蛋白抗血清发生特异性反应[3]。本研究克隆的camp基因与公布的RA-GD、RA-CH-1及ATCC11845等序列同源性为99%，表明其在RA菌株间具有非常高的同源性，可以用于RA的鉴定。同时，western blot分析表明该蛋白还可以与10、11、17型菌株全菌体阳性血清发生特异性反应，进一步表明该蛋白是众多血清型菌所共有的，并且具有良好的免疫原性。Jiang等将Camp因子作为组分用于研制乳房链球菌疫苗并取得了成功[8]，因此推测RA的Camp因子也可以作为亚单位疫苗组分用于该病的防控。

本研究建立的检测Camp的间接ELISA检测方法，经验证具有良好的特异性和重复性，与全菌体裂解抗原ELISA方法的符合率达到77.5%，但抗体阳性检出率显著低于全菌体裂解抗原ELISA方法。推测其原因是Camp作为RA的毒力因子，只有活菌在感染过程中表达才能被检测到，与方钦的研究结果具有一定的符合性[9]，提示该ELISA方法可以用于RA血清学流行病学调查，也为深入研究Camp提供了依据。

[1]Teo T P,Tan H C,Loh H.Protective efficacy of a bivalent Pasteurella anatipestifer broth-grown bacteria in ducklings[J].Singapore JPri Ind,1992,20:53-60.

[2]王小兰，胡青海.血清1型鸭疫里默氏杆菌灭活油乳剂疫苗的研制[J].中国预防兽医学报，2012，34(4)：313-316.

[3]Crasta K C,Chua K L.Identification and characterization of CAMP cohemolysin as a potential virulence factor of riemerella anatipestifer[J].JBacteriol,2002,184(7):1932-1939.

[4]程龙飞，施少华.2型鸭疫里氏杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立与应用[J].福建农业学报，2006，21(2)：131-134.

[5]郭宇飞，程安春，汪铭书，等.鸭疫里氏杆菌病四价灭活疫苗的研究[J].中国兽医科技，2003，33(6)：3-10.

[6]谢永平，陈泽祥，许力干，等.鸭疫里氏杆菌油乳剂三价灭活疫苗的研究[J].动物医学进展，2010，31(7)：45-48.

[7]胡清海，刘晓文，赵世华，等.鸭疫里氏杆菌病三价油乳剂灭活疫苗的研究[J].中国兽医科技，2002，32(7)：6-9.

[8]Jiang M,Potter A A,MacLachlan P R.Camp factor of streptococcus uberis[P].US,5863543,1999,1.

[9]方钦.间接ELISA方法检测鸭疫里默氏杆菌抗体方法的建立及应用[D].重庆：西南大学，2007，6.