三种斑蝥素盐类物质对肝癌QGY－7703细胞生长的抑制作用

李晓飞 娄方明 晏 容 侯晓晖 张 恒 刘 云 (遵义医学院基础医学院，贵州 遵义 563003)

斑蝥味辛，性温，有大毒，是我国首先发现的一种具有抗肿瘤作用的昆虫类药物〔1〕。现代药学研究表明斑蝥中的主要活性成分是斑蝥素(CA)，能明显抑制多种动物移植性肿瘤〔2～4〕，对多种肿瘤细胞具有较强的杀伤和抑制作用，如胃癌、肺癌、食管癌、前列腺癌、宫颈癌和喉癌等〔5〕。斑蝥素虽然具有良好的抗癌性能，但其毒性较大，在治疗癌症的同时会引起一系列毒副作用〔6〕。鉴于此，已有研究者合成了一系列斑蝥素衍生物，如去甲斑蝥素和甲基斑蝥胺等，以期达到既保留斑蝥素的抗癌作用，又减轻其毒副作用的效果。为了寻找更多具有抗肿瘤活性的斑蝥素衍生物，课题组以提取自眼斑芫菁体内的斑蝥素为原料，自制合成了三种斑蝥素衍生物:斑蝥素酸镁、斑蝥素酸钾及斑蝥素酸钠，并初步考察了其体外抗肿瘤的活性。

1 材料与方法

1.1 材料及主要试剂 人肝癌QGY-7703细胞株购自中国科学院细胞库。斑蝥素酸镁、斑蝥素酸钠和斑蝥素酸钾由自制斑蝥素合成;RPMI-1640培养基购自美国GIBCO公司;南美胎牛血清、胰蛋白酶购自美国HYCLONE公司;WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

1.2 主要仪器 CO2培养箱3131型，美国Thermo公司;Multiskan spectrum酶标仪，美国Thermo公司;超纯水制备系统，美国Millipore公司。

1.3 QGY-7703肝癌细胞的培养 QGY-7703肝癌细胞用RPMI-1640培养基(含有10%胎牛血清)，在37℃、5%饱和湿度CO2培养箱中培养;待细胞生长至对数生长期，弃培养液，PBS冲洗，0.25%胰蛋白酶37℃消化，于倒置显微镜下见细胞间隙增大、胞质回缩即终止消化。倒掉胰酶，加入培养液，轻轻吹打至单细胞悬液，备用。

1.4 WST-1法测定细胞毒实验 调整细胞浓度为80 000 个/ml，以每孔 100 μl接种于 96 孔板中，置于 37℃、5%饱和湿度CO2培养箱中过夜培养，次日加入100 μl系列含不同药物浓度的RPMI-1640培养液，并同时设无药对照组(培养液中有细胞)和空白对照组(培养液中无细胞)。每组设4个复孔;培养24 h后，每孔加入20 μl WST-1溶液，置于培养箱中继续培养2 h。按照试剂盒方法，检测波长450 nm，酶标仪检测每孔的吸光度(OD)值。计算抑制率，并以药物浓度为横坐标，细胞生长抑制率为纵坐标绘制回归曲线，求出半数抑制浓度(IC50)。抑制率%=〔1－(药物组OD值－空白对照OD值)/(对照OD值－空白对照OD值)〕×100%。

2 结果

2.1 斑蝥素酸镁对肝癌QGY-7703细胞生长的抑制作用 斑蝥素酸镁对肝癌QGY-7703细胞的生长抑制作用在2.01～32.16 μmol/L范围内与剂量呈正相关。以药物浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作对数曲线，得回归方程y=22.808Ln(x)-1.292 8，相关系数 r为0.991，经计算半数抑制浓度(IC50)为9.48 μmol/L。见表1。

表1 斑蝥素酸镁对肝癌QGY-7703细胞增殖的影响(±s，n=4)

表1 斑蝥素酸镁对肝癌QGY-7703细胞增殖的影响(±s，n=4)

组别 斑蝥素酸镁(μmol/L) OD450(±s) 抑制率(%)0.376±0.011 －无药对照组 0 0.741±0.021) －T1 2.01 0.682±0.0031) 16.16 T2 4.02 0.634±0.011) 29.32 T3 8.04 0.571±0.0141) 46.58 T4 16.08 0.527±0.0171) 58.63 T5 32.16 0.447±0.0131)空白对照组0 80.55

2.2 斑蝥素酸钠对肝癌QGY-7703细胞生长的抑制作用 其抑制作用在8.85～141.59 μmol/L范围内与剂量呈正相关。以药物浓度为横坐标抑制率为纵坐标作对数曲线，得回归方程y=24.596Ln(x)-36.585，相关系数r=0.998 9。经计算半数抑制浓度(IC50)为33.80 μmol/L。见表2。与空白对照组比较:1)P＜0.05，下表同

表2 斑蝥素酸钠对肝癌QGY-7703细胞增殖的影响(±s，n=4)

表2 斑蝥素酸钠对肝癌QGY-7703细胞增殖的影响(±s，n=4)

组别 斑蝥素酸镁(μmol/L) OD450(±s) 抑制率(%)0.393±0.009 －无药对照组 0 0.752±0.0111) －T1 8.85 0.693±0.0061) 16.43 T2 17.7 0.630±0.0181) 33.98 T3 35.4 0.565±0.0121) 52.09 T4 70.8 0.504±0.0071) 69.08 T5 141.59 0.450±0.0161)空白对照组0 84.12

表3 斑蝥素酸钾对肝癌QGY-7703细胞增殖的影响(±s，n=4)

表3 斑蝥素酸钾对肝癌QGY-7703细胞增殖的影响(±s，n=4)

组别 斑蝥素酸镁(μmol/L) OD450(±s) 抑制率(%)0.361±0.002 －无药对照组 0 0.753±0.0061) －T1 7.75 0.706±0.0081) 11.99 T2 15.5 0.643±0.0131) 28.06 T3 31.01 0.559±0.0111) 49.49 T4 62.02 0.495±0.0091) 65.82 T5 124.03 0.442±0.0161)空白对照组0 79.34

2.3 斑蝥素酸钾对肝癌QGY-7703细胞生长的抑制作用 如表3所示，斑蝥素酸钾对肝癌QGY-7703细胞的生长抑制作用在7.75～124.03 μmol/L范围内与剂量呈正相关。以药物浓度为横坐标抑制率为纵坐标作对数曲线，得回归方程y=24.878 Ln(x)－38.495，相关系数r=0.994 5。经计算半数抑制浓度(IC50)为 35.04 μmol/L。

3 讨论

实验结果显示，斑蝥素酸镁、斑蝥素酸钠以及斑蝥素酸钾对肝癌QGY-7703细胞的生长具有显著的抑制作用。对肝癌QGY-7703细胞的抑制作用最强的为斑蝥素酸镁，其次是斑蝥素酸钠，最弱的是斑蝥素酸钾。三种斑蝥素盐类物质中研究最多的为斑蝥素酸钠，且已作为临床抗癌药物使用。已有研究报道〔7～9〕斑蝥素酸钠能有效抑制人肝癌HepG-2细胞增殖而对人正常肝细胞LO2抑制率较小，在临床上有助于改善中晚期肝癌患者的临床症状和生活质量，可减少化疗毒副反应。本次实验结果提示斑蝥素酸钠对治疗肝癌的效果可能没有斑蝥素酸镁好，因此课题组在今后的工作中将重点考察斑蝥素酸镁对肝癌的抑制作用及其机制。

另外，实验结果表明斑蝥素酸钠对肝癌QGY-7703增殖的抑制效果好于斑蝥素酸钾，但课题组在前期的工作中发现斑蝥素酸钾对胃癌SGC-7901细胞的抑制作用要好于斑蝥素酸钠〔10〕。因此，我们推测三种斑蝥素盐类物质都能有效抑制肿瘤细胞的生长，只是具有选择性，其选择性需要进一步探索验证。此外，三种斑蝥素盐类物质水溶性好均明显好于斑蝥素，这一性质有助于将其开发成注射剂，应用于临床。

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5 魏方超，杜 娟，未宁宁，等.斑蝥素及其衍生物的研究现状与应用〔J〕.现代生物医学进展，2012;12(8):1586-9.

6 邹建军，张胜强，冯瑞祥.斑鳌素毒性及其药(毒)动力学研究〔J〕.中国药科大学学报，2002;33(5):393.

7 房德芳，王明艳.斑蝥酸钠抑制肝癌细胞生长的实验研究〔J〕.辽宁中医杂志，2007;34(6):845-7.

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9 张爱萍.斑蝥酸钠对中晚期肝癌患者生活质量的影响〔J〕.中国康复理论与实践，2011;17(7):679-81.

10 张 恒，李晓飞，陈祥盛.斑蝥素、斑蝥素酸钾及斑蝥素酸钠作用胃癌细胞的研究〔J〕.山地农业生物学报，2011;30(1):52-5.