凋亡相关基因bax在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

刘瑞芬 蒋军广 张晓燕 杨 超 孙 曼 史 江

(郑州大学第一附属医院 河南省呼吸疾病研究所 河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室，河南 郑州 450052)

肺癌是当前发病率和死亡率极高的恶性肿瘤之一。研究表明，细胞凋亡在肺癌的发生、发展中起着重要作用。但哪些基因、蛋白与肺癌细胞凋亡及预后密切相关尚需进一步研究。bax基因为bcl-2基因家族中的重要一员，多与bcl-2形成二聚体共同调节细胞凋亡。本文主要研究bax在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及与细胞凋亡的关系，以期为NSCLC的早期诊断、治疗和评估预后提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 对象 随机选取郑大一附院病理科2009～2011年外科切除的NSCLC标本60例，年龄36～87岁，所有病人在术前均未接受化、放疗，病理诊断明确。其中男40例，女20例;鳞癌30例，腺癌30例;高分化15例，中、低分化45例;按照美国联合癌症分类委员会和国际抗癌联盟制定的标准，TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期共39例，Ⅲ期和Ⅳ期共21例;有淋巴结转移者27例，无淋巴结转移者33例;有胸腔积液者11例，无胸腔积液者49例。另设20例对照组，为癌旁正常组织(经病理证实)，所有标本均为蜡块包埋，由专业人员切片，每例3片。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 兔抗-Caspase-3(Active)、兔抗-bax均购于北京博奥森生物技术公司;凋亡试剂盒购于美国罗氏公司;SP9000试剂盒、DAB试剂盒，购自北京中杉生物工程公司。

1.2.2 免疫组化染色 将随机所选的60例肺癌组织及20例正常对照组织交由病理科切片，切完后随即放入60℃烤箱内烘烤3小时，切片脱蜡至水，将切片放入装有抗原修复液的缸子中，放入微波炉高温5 min，低温10 min后取出进行抗原修复，过氧化物酶阻断剂阻断内源性过氧化物酶活性;非免疫性动物血清阻断非特异性反应;滴加一抗;加生物素标记的二抗;滴加辣根酶标记卵霉链白素;DAB显色;苏木素复染;梯度酒精脱水;中性树胶封片。

1.2.3 细胞凋亡的检测 将切片脱蜡至水，滴加蛋白酶K，滴加TUNEL反应混合液，滴加POD转换剂，DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，中性树胶封片。

1.2.4 bax阳性结果判定 bax染色为细胞质或(和)细胞膜出现棕黄色颗粒，定位准确且无背景染色，分三步:(1)判定颜色，观察所有片子的染色，无染色，也就是与背景染色无明显差别为0分;浅染色为细胞质或(和)细胞膜染为浅棕黄色，与背景颜色有差别，为1分;染为棕黄色，介于1与3分之间，为2分;染为深棕黄色，与背景颜色差别显著为3分。(2)看染色细胞比例，高倍镜(400倍)下每个视野计数100个细胞，每张切片计数5个视野，计算阳性细胞数占总癌症细胞的百分比。0%为0分，0% ～10%为1分，10% ～50%为2分，＞50%为3分。(3)两者所得数值相加的分值结果为总分值，总分值＜4为阴性，≥4为阳性。

1.2.5 凋亡细胞的阳性结果判定及凋亡指数(AI)的计算凋亡细胞经TUNEL法处理后，细胞核被染为棕黄色，使用光学显微镜，计数每1 000个肿瘤细胞中凋亡细胞个数。需排除有严重的炎症反应和坏死灶的区域，以免造成假阳性。AI为计数每1 000个肿瘤细胞中凋亡细胞所占的比例。

1.3 统计学分析 应用SPSS17.0软件包处理。采用配对四格表的χ2检验及直线相关性分析。

2 结果

2.1 NSCLC组织中bax的表达及与临床病理特征的关系 肺癌组织60例中bax阳性31例(48.3%)，癌旁正常组织20例中bax阳性12例(60%)，两者差异无统计学意义(χ2=0.419，P=0.517)，但癌组织的染色均要深于正常组织。结果显示，高分化组织的阳性表达率高于中低分化，有淋巴结转移者阳性率较无淋巴结转移者低，TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期阳性率高于Ⅲ、Ⅳ期阳性率(均P＜0.05)。Bax的表达与年龄、性别、病理分型、是否合并胸腔积液、肿瘤直径、是否吸烟、肿瘤生长在左肺还是右肺无明显关系(P＞0.05)。见表1。

表1 NSCLC中bax的表达及于临床病理特征的关系〔n(%)〕

2.2 bax与细胞凋亡之间的关系 bax分值0、1～2、3～4、5～6分的各组 AI分别为 3.57±0.55、5.44±1.41、8.05±1.40、10.05±1.62，相关性分析显示bax积分与AI呈正相关(r=0.855，P=0.000)。

3 讨论

近年来，凋亡异常在肿瘤的发生中所起的作用越来越受重视。凋亡过程的紊乱与肿瘤产生关系密切，它受多种基因的调控，包括凋亡促进基因、凋亡抑制基因，各种凋亡效应基因共同作用〔1～3〕。bax基因为凋亡促进基因。近年来，大量学者对bax、bcl-2联合研究，并认为两者的比值与肿瘤发展关系密切。bax存在于人体各个组织，研究表明它与肝癌、胃癌、骨肉瘤、血管瘤、脑损伤〔4～8〕的发生都有密切关系。

本实验结果显示bax在肺癌组织与癌旁正常组织中表达无明显差异，与魏卫等〔9〕的结论一致。但辛彩霞等〔10，11〕研究结论认为bax在肺癌组织中的表达要高于癌旁正常组织，另有学者〔12，13〕认为bax在肺癌组织中的表达要低于癌旁正常组织、产生分歧的原因可能为:①实验样本量较小造成的误差;②凋亡不足是肿瘤发生的原因，但肿瘤往往存在过度增殖，也可能存在大量凋亡，只是增殖的速度大于凋亡，这还需要大量的研究去证实。大量研究〔12，13〕认为bax蛋白在NSCLC中的表达低于正常肺组织，在高、中分化患者中的表达高于低分化者。本实验结果与王鸿程等〔14〕的研究结果一致，提示bax表达下调可能与肿瘤的恶性程度有关，对其进行检测有可能提示NSCLC患者的肿瘤恶性程度及判断预后;者阳性率(33.3%)较无淋巴结转移者(66.7%)低，本研究结果还提示bax表达下调在肿瘤的早期转移有一定关系，bax表达下调的患者预后不好，与文献〔15〕报道一致。bax表达与凋亡呈正相关，提示bax基因下调或缺失导致凋亡减少，与肿瘤的发生、发展密切相关。

bax基因的表达与NSCLC的临床分期、分化程度及淋巴结转移密切相关，但bax基因能否成为诊断NSCLC的肿瘤标记物及判断其预后的有效指标，还有待于更多的研究去证实。

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