新疆汉族冠心病患者内皮型一氧化氮合酶基因G894T多态性

江雪萍 徐艳萍 杨忠伟 肖 白 冯秀丽 (新疆生产建设兵团农七师医院心内科，新疆 奎屯 833200)

冠心病是由遗传和环境因素共同作用所致的复杂疾病，发病过程与多基因之间和基因-环境之间的相互作用等有关，可能存在多个与冠心病相关的基因，这些基因单个起作用或联合作用，还可能与传统易感因素共同作用而增加冠心病的危险性。我们应用聚合酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)检测了新疆82例汉族正常个体和42例冠心病患者eNOS基因G894T突变的情况。

1 材料与方法

1.1 研究对象 随机抽取124例新疆地区无血缘关系的汉族正常人群和汉族冠心病患者的静脉血各3 ml，EDTA.K2抗凝，充分混匀后放入－20℃冰箱冷藏室保存待检。汉族正常人群经检查已排除冠心病、高血压、糖尿病及脑血管病。82例中男47例，女35例，年龄18～62岁;汉族冠心病人42例，其中男31例，女11例，年龄30～79岁。汉族冠心病人均符合1979年WHO冠心病诊断标准且心电图检查均为陈旧性心肌梗死患者。

1.2 主要仪器 Master cycler Reppendorf PCR仪(梯度核酸扩增仪)，购自上海艾本德生物技术国际贸易有限公司;2.5%琼脂糖凝胶电泳EB染色、上海生物工程有限公司试剂盒。UVP AC暗箱+GEL相机凝胶成像仪，购自天美有限公司。

1.3 DNA的提取 常规酚抽提法提取基因组DNA。BioRad紫外分光光度计测定DNA浓度并标化至100 ng/μl。

1.4 多聚合酶链反应检测eNOS基因G894T多态性 ①引物设计与合成参照文献〔1〕设计引物:上游引物5'-AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA-3';下游引物:5'-CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA-3';② PCR扩增:反应体系为25 μl，包括 DNA模板 1.0 μl、10 × 缓冲液 (Mg2+)2.5 μl，dNTP Mix 2.0 μl，正义链引物 0.2 μl，反义链引物 0.2 μl Taq 酶 0.2 μl，纯净水 18.9 μl;③PCR仪扩增反应条件:预变性为95℃ 2 min，变性95℃ 30 s，退火66℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，共37个循环，最后72℃延伸5 min。扩增后的PCR产物为248 bp，经2.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，100 V，30 min，置凝胶成像仪上观察特异性条带，打印并记录了实验结果;④基因型检测:限制性酶切反应体系10 μl，包括 PCR 产物 8.4 μl、10 × 缓冲液 1 μl、BaⅡ内切酶(大连宝提供)0.6 μl，37℃酶切2 h终止。酶切产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪成像，观察基因型。

1.5 统计学分析 计算新疆汉族正常人群和冠心病患者两组基因型频率和等位基因频率，经过Hardy Weinberg遗传平衡定律检验，表明各基因型频率已达遗传平衡，具有群体代表性。各组间频率比较用χ2检验。

2 结果

2.1 电泳结果 G等位基因存在BanⅡ酶切位点，而T等位基因没有BanⅡ酶切位点。因此GG基因型酶切产物为163和85 bp，GT基因型具有248和163 bp，TT基因型酶切产物为248 bp，结果见图1、图2。

图1 汉族正常人群PCR产物及经BanⅡ酶切后琼脂糖凝胶电泳

图2 汉族冠心病人PCR产物及经BanⅡ酶切后琼脂糖凝胶电泳

2.2 新疆汉族正常人群eNOS基因频率 在82例样品中，GG型69例，GT型10例，TT型3例，三种基因型的频率分别为0.84、0.12、0.04，G 和 T 等位基因分布频率分别为 0.90、0.10。经χ2检验，这些比例与 Hardy Weinberg平衡相一致(χ2=0.166 4，P＞0.05)，具有群体代表性。等位基因频率分布男女间无显著性差异(χ2=0.004 1，P ＞0.05)，见表1。

表1 新疆汉族正常人群eNOS基因型及等位基因频率分布

2.3 新疆汉族冠心病人eNOS基因频率 在42例样品中，GG型32例，GT型6例，TT型4例，三种基因型的频率分别为0.76、0.14、0.10，G 和 T 等位基因的频率分别为 0.83、0.17。经χ2检验，这些比例与 Hardy Weinberg平衡相一致(χ2=0.305 7，P＞0.05)，具有群体代表性。等位基因频率分布男女间无显著性差异(χ2=0.024 6，P＞0.05)。见表2。

表2 新疆汉族冠心病人eNOS基因型及等位基因频率分布

2.4 新疆汉族82例正常人群与42例冠心病人eNOS基因G894T多态性GG、GT、TT及G和T等位基因分布频率比较，新疆汉族冠心病人eNOS基因G894T多态性有GG基因型频率下降，TT基因型频率升高趋势，但与汉族正常人相比差异不显著(χ2=1.532 8，P＞0.05)。而G和T等位基因频率分布也有上述趋势，但差异不显著(χ2=0.682 1，P＞0.05)。见表3。

3 讨论

eNOS是左旋精氨酸一氧化氮途径的关键酶，eNOS催化生成的NO具有舒张血管、调节血流、抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移和清除超氧自由基、抑制血小板聚集、黏附和白细胞的趋化激活等重要功能，是心血管系统抗动脉粥样硬化、防止血栓形成和维持正常血管舒缩反应中必不可少的保护因子〔2〕。有研究发现eNOS基因第7外显子中的G894T突变和冠心病的发病及心肌梗死的风险有关〔3，4〕。Colombo 等〔5〕的研究显示G894T错义突变与意大利人冠心病的存在和严重程度相关。eNOS基因分布不同，存在种族差异〔6〕。本研究发现新疆汉族冠心病人中存在eNOS基因G894T多态性GG基因型频率下降，TT基因型频率升高趋势，G和T等位基因频率分布也有上述趋势，但与汉族正常人差异不显著，可能与年龄差异以及样本量小有关，目前还不能完全排除新疆汉族冠心病的发生与eNOS基因G894T突变的相关性，有待进一步研究。

1 Adam V，Benjafield D，Brain J.Morris association analysis of endothelial nitric oxide synthase gene in essential hypertension J〔J〕.Am J Hypertension，2000;13:994-8.

2 Lefer AM.Nitric oxide nature's naturally occurring leukocyte inhibitor〔J〕.Circulation，1997;95(3):553-4.

3 Lee WH，Hwang TH，Oh GT，et al.Genetic factors associated with endothelial dysfunction affect the early onset of coronary artery disease in Korean males〔J〕.Vasc Med，2001;6:103-8.

4 唐欧杉，徐 耕，秦丰明，等.内皮型一氧化氮合酶基因多态性和早发冠心病的相关性研究〔J〕.岭南心血管病杂志，2004;10:293-6.

5 Colombo MG，Andreassi MG，Paradossi U，et al.Evidence for association of a common variant of the endothelial nitric oxide synthase gene(Glu298 Asp polymorphism)to the presence extent and severity of coronary artery disease〔J〕.Heart，2002;87(6):525-8.

6 Miyamoto Y，Saito Y，Kajiyama N，et al.Endothelial nitric oxide synthase gene is positively associated with essential hypertension〔J〕.Hypertension，1998;32:38.