茄子褐纹病病原鉴定及其生物学特性研究

吴仁锋 杨绍丽 杨德枝

（武汉市蔬菜科学研究所，湖北武汉 430065）

茄子褐纹病病原鉴定及其生物学特性研究

吴仁锋 杨绍丽 杨德枝

（武汉市蔬菜科学研究所，湖北武汉 430065）

2010～2011年采用室内离体接种致病性测定、形态学鉴定方法对武汉市茄子褐纹病病原进行研究，并测定了其相关生物学特性。从武汉市各茄子种植区采集茄褐纹病病样，分离获得来自茄子病株叶、茎、果等器官的15个生长较一致的真菌分离物；经致病性试验证实，分离物均为茄子褐纹病病原菌；经形态学鉴定，15个菌株均为Phomopsis vexans。生物学特性研究结果表明：该病原菌最适生长的培养基为PDA和PSA，最适宜产孢培养基为燕麦培养基；菌丝生长的最适温度为25～30 ℃；最适pH值为4～7；光照有利于菌丝生长；能够利用多种碳源和氮源，碳源以麦芽糖利用效果最好，氮源以硝酸钠利用效果最好；菌丝生长的致死温度为55 ℃ 25 min。

茄子；褐纹病；病原鉴定；生物学特性

茄子褐纹病（吕佩珂 等，2008）是一种世界性病害，在茄子生产中可造成严重的经济损失。近几年此病害在湖北省也普遍发生，尤其露地栽培发生更为严重，从苗期到成株期均可受害（吴仁锋，2011）。最为严重的是褐纹病对茄子采种危害甚大，许多田块常因此病的大面积发生而导致种子严重减产甚至绝收（中国农作物病虫害编辑委员会，1979）。

为弄清湖北地区茄子褐纹病病原以及该病菌对不同理化环境和营养条件的需求，本试验对其病原进行了分离鉴定，并对其生物学特性进行了较为系统的研究，以期为研究该 病害的发生规律和防治技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病样采集

2010年和2011年在武汉市蔬菜科学研究所张家湾基地、黄陂武湖基地的茄子种植区采集感染茄子褐纹病的病样，包括病叶、病茎及病果。

1.2 病原菌分离鉴定

病菌的组织分离（方中达，1998）：从试验田采取典型的病果、病茎及病叶，无菌水冲洗晾干，75%酒精消毒，无菌刀片切取病健交界处10 mm×10 mm的组织，用0.1%升汞溶液表面消毒3～5 min，无菌水冲洗3次，吸干组织块表面水分，再将可能被杀死的组织剪去，接入PDA培养基，每皿3～5块，置于25 ℃恒温箱中培养观察。菌丝萌发后，选典型菌落转接3次，7 d后用内径为6 mm的打孔器从菌落边缘打取菌饼，转接于PDA平板上纯化培养。待病菌长出分生孢子器及分生孢子时，镜检观察菌丝、分生孢子器及分生孢子的形态，并根据真菌鉴定手册进行病原菌鉴定。

1.3 病原菌致病性测定

参照任锡伦和张汉卿（1993）的方法测定病原菌致病性，略作修改。孢子悬浮液制备：取实验室分离纯化菌种，在PDA平板上培养至产生黑色分生孢子器，用消毒镊子夹取分生孢子器，用消毒玻片碾压散出分生孢子后用无菌水冲洗，充分混匀后，静置片刻，取上清液，观察分生孢子量，显微观察每个视野20个孢子左右，将剪好的5 mm×5 mm的滤纸片放入孢子液中，充分浸湿备用。接种方法：取在室内验证的无病健果，用消毒解剖刀在健康无病的茄子果实上划5 mm长“十”字伤口，取上述滤纸片贴在“十”字伤口处，用喷壶喷水保湿。在25～28 ℃条件下保湿培养，7 d后调查结果。对照用无菌水接种。

病原菌的再分离：从接种发病部位的病健交界处，剪取10 mm×10 mm小块病组织，用常规的组织分离法再次分离病原菌，鉴定PDA平板上长出的病菌与接种用菌株形态是否一致，采用柯赫氏法则验证。

1.4 病原菌生物学特性观察

1.4.1 培养基对菌丝生长及产孢的影响 供试5种培养基：PDA培养基、PSA培养基、查氏培养基、燕麦培养基（方中达，1998）、蛋白胨培养基（黄思良 等，1998）。将PDA平板上培养5 d的菌株HZ-4沿菌落边缘用打孔器打取直径6 mm的菌饼，分别移置不同培养基平板中央，置于25 ℃恒温培养箱中培养，每处理3次重复，3 d后采用十字交叉法测量菌落的直径，再培养7 d后测定产孢情况。

1.4.2 光照对菌丝生长的影响 将PDA平板上培养5 d的菌株HZ-4沿菌落边缘用打孔器打取直径6 mm的菌饼，接种于PDA平板中央。置于25 ℃ HP250GS智能型人工气候培养箱中培养。设置连续黑暗、12 h光暗交替、连续光照3个处理（光源为普通日光灯18 W，22 cm），每处理3次重复，3 d后采用十字交叉法测量菌落直径。

1.4.3 温度对菌丝生长的影响 将PDA平板上培养5 d的菌株HZ-4沿菌落边缘用打孔器打取直径6 mm菌饼，接种于PDA平板中央。置于5、10、15、20、25、28、30、35、40 ℃的恒温培养箱中培养，每处理3次重复，3 d后采用十字交叉法测量菌落直径。

1.4.4 pH值对菌丝生长的影响 用1 mol·L-1NaOH和1 mol·L-1HCl调节PDA培养基的pH值，分别为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12。在不同pH值的平板上接种直径为6 mm的菌饼，置于25 ℃恒温培养箱培养，每处理3次重复，5 d后采用十字交叉法测量菌落直径。

1.4.5 碳、氮源对菌丝生长的影响 以Czapek培养基为基础培养基（方中达，1998）。用含碳量相同的葡萄糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、可溶性淀粉代替其中的30.0 g蔗糖，以不加碳作对照。用含氮量相同的尿素、硝酸钠、硝酸铵、氯化铵、精氨酸代替其中的2.00 g硝酸钾，以不加氮作对照。打取直径为6 mm的菌饼，接种在不同碳、氮源平板中央，每处理3次重复。置于25 ℃恒温培养箱中培养，5 d后采用十字交叉法测量菌落直径。

1.4.6 菌丝致死温度测定 将PDA平板上培养7 d的菌株HZ-4沿菌落边缘用打孔器打取直径6 mm的菌饼，置于无菌试管中，加入2 mL无菌水。分别在45、50、55、60、65、70 ℃水浴锅中分别处理10、15、20、25 min，取出试管迅速冷却，将菌饼取出置于PDA平板上25 ℃恒温培养，3 d后观察其生长情况，每处理5次重复。

2 结果与分析

2.1 田间症状

从田间采集茄子发病叶片、病茎及病果（图1）。叶片受害后，先在下部叶片上出现苍白色圆形斑点，发展扩大后，病斑呈近圆形或不规则形，边缘变为褐色，中间浅褐色或灰白色，其上轮生许多小黑粒点，后期病斑扩大连片，常造成干裂、穿孔、脱落（图1-a）。茎枝发病，病斑梭形，边缘深紫褐色，中间灰白色凹陷，上生许多黑色小粒点，病斑发展后，病组织干腐，皮层脱落，露出木质部，容易折断，病斑多时，可连结成大的坏死区域（图1-b）。果实受害，初期表现为浅褐色椭圆形凹陷斑，上生许多黑色小粒点，病斑不断扩大，可达半个果实，后期病斑发展为灰白色（图1-c）。发病严重的，果实上可布满病斑，尤其是留种茄（图1-d），可导致颗粒无收。

图1 茄子褐纹病田间发病症状

2.2 病原菌鉴定

按常规的组织分离法进行分离，分离的病组织在PDA培养平板上培养5～7 d，转皿纯化。共获得来自病叶、病茎及病果（图2）的分离物15个。茄子褐纹病菌在PDA上，气生菌丝细密，轮纹明显，边缘整齐（图3）。培养10 d以上才有黑色分生孢子器产生，挑取黑色分生孢子器，载玻片上压碎，镜检可以观察到凸透镜型有孔口的分生孢子器（图4），压破的分生孢子器有无数椭圆形或纺锤形孢子（α型分生孢子）从孔口溢出，尺寸为（5～8） μm×（2～8） μm，通常内含2～3个油球（图5）。参照真菌鉴定手册（魏景超，1979）及中国真菌志（戚佩坤 等，2007），根据病害发生症状、菌落形态、分生孢子器及分生孢子形态，鉴定该病菌为拟茎点霉属真菌Phomopsis vexans。

图2 田间茄子病果上分生孢子器形态

图3 茄子褐纹病菌在PDA上菌落形态

图4 镜检茄子褐纹病菌分生孢子器形态

图5 茄子褐纹病菌α型分生孢子形态

2.3 病原菌致病性测定

采用离体茄果进行致病性测定。结果表明，接种分生孢子悬浮液的茄果不同程度的发病，对照无明显症状。对已发病果实进行常规组织分离，同样可以分离得到和原来一样的病菌，由此可以说明分离得到的15个菌株均为引起茄子褐纹病的致病菌。

2.4 病原菌生物学特性观察

2.4.1 不同培养基对菌丝生长及产孢的影响 茄子褐纹病菌菌株HZ-4在5种培养基上的培养性状及产孢情况见表1。其中能够产孢的培养基有 PDA、PSA、燕麦，其产孢量依次为燕麦＞PDA≥PSA，产孢时间均在10 d以上。菌丝生长较好的培养基有PDA、PSA和燕麦，不适合菌丝生长的培养基为查氏和蛋白胨。

2.4.2 光照对菌丝生长的影响 在PDA平板上连续黑暗、连续光照、12 h光暗交替条件下培养3 d，茄子褐纹病菌菌落平均直径分别为55.75、70.58、61.58 mm。说明，光照条件较有利于菌丝的生长（图6）。

表1 茄子褐纹病菌菌株HZ-4在不同培养基上的菌落特征及产孢情况

2.4.3 温度对菌丝生长的影响 由图7可以看出，在PDA平板上，茄子褐纹病菌菌丝在10～35 ℃下均能生长；25～30 ℃为菌丝生长的适宜温度，其中菌株在30 ℃时培养3 d菌落直径最大达67.5 mm；菌丝在5 ℃和40 ℃下几乎停止生长。

图6 不同光照对茄子褐纹病菌菌丝生长的影响

图7 不同温度对茄子褐纹病菌菌丝生长的影响

2.4.4 pH值对菌丝生长的影响 由图8可以看出，在PDA平板上，pH值在3～12之间茄子褐纹病菌菌丝均可生长，以pH值4～7最适；当pH值为6时，菌丝生长量最大；在pH值为12时，菌丝生长受到强烈抑制。总体来看，偏酸的环境适宜茄子褐纹病菌菌丝生长。

2.4.5 碳、氮源对菌丝生长的影响 从表2可以看出，菌株HZ-4对供试的7 种碳源均可利用，其中以麦芽糖利用效果最好，其次是葡萄糖、蔗糖，以不加碳源生长最差，说明碳源有利于菌丝生长。菌株HZ-4对供试的6 种氮源均可利用，其中以硝酸钠利用效果最好，其次是硝酸钾、硝酸铵、氯化铵，对尿素的利用效果最差，以不加氮源生长最快，说明氮源对菌丝生长有一定的抑制作用。

2.4.6 菌丝致死温度 由表3可以看出，在45、50 ℃水浴中分别处理 10、15、20、25 min，以及在55 ℃水浴中分别处理10、15 min的茄子褐纹病菌菌丝接种在PDA平板上都萌发形成新的菌落，经55 ℃ 20 min处理的菌丝5个平板中仅1个能形成新的菌落，而经55 ℃ 25 min处理的菌丝不能再继续生长，说明茄子褐纹病菌菌丝的致死温度为55 ℃ 25 min。

图8 不同酸碱度对茄子褐纹病菌菌丝生长的影响

表2 不同碳源、氮源对茄子褐纹病菌菌丝生长的影响

表3 茄子褐纹病菌菌丝的致死温度

3 结论与讨论

经病原菌分离和接种试验，证实引起本所张家湾基地和武湖基地的茄子褐纹病病原为半知菌亚门球壳孢目拟茎点霉（Phomopsis vexans）。茄子褐纹病菌α型分生孢子呈椭圆形或纺锤形，通常内含2～3个油球；β型分生孢子呈细长线状，并在一端弯曲成钩，两者均为无色单胞（魏景超，1979）。这两种类型的孢子可产生在同一分生孢子器内。一般叶片上多为α型分生孢子，β型分生孢子较为少见，如有则多长在茎秆及果实上。线状分生孢子不能萌发。周永力等（1998）认为油球是Phomopsis属的一个稳定特征，可作为该属的判断依据，温度是产生不同孢子的主要因素，不同类型孢子形态的产生与所发病植株的部位有关。本试验中分离得到的茄子褐纹病菌仅观察到α型分生孢子，且油球多数情况下为2个（一端一个），在人工培养条件及自然发病条件下均未发现β型分生孢子。说明自然状态下α型分生孢子广泛存在于寄主病茎、病叶及病果上。

生物学特性研究表明：PDA培养基适合培养褐纹病菌，燕麦培养基适合作为褐纹病菌的产孢培养基和保存用。在PDA平板培养基上，菌丝生长适宜温度为25～30 ℃，适宜pH值为4～7，菌丝致死温度为55 ℃ 25 min，光照有利于菌丝生长。该菌能利用多种碳源和氮源，碳源以麦芽糖利用效果最好，在无碳培养基上菌丝生长最差；氮源以硝酸钠利用效果最好，其次是硝酸钾、硝酸铵、氯化铵，表明硝态氮较有利于该病原菌的生长，可以利用该菌对氮源利用的差异来合理施肥，控制病害的发生。

经病原菌的分离培养、形态学鉴定以及柯赫氏法则验证，引起武汉市的茄子褐纹病的病原为Phomopsis vexans，是一种能够以多种碳、氮源为营养来源，适宜偏酸性环境的病原真菌。本试验研究了部分环境因子和营养物质对该病原菌菌丝生长和产孢的影响，还需进一步研究其他因子如相对湿度等对该菌生长和发育的影响，以及分生孢子的生物学特性，为了解病菌侵染和病害流行奠定基础。

方中达．1998．植病研究方法．3版．北京：中国农业出版社．

黄思良，赵艳珠，黄连江，韦刚．1998．不同培养基对芒果炭疽病菌分生孢子形成的影响．西南农业学报，11（1）：62-66．

吕佩珂，苏慧兰，高振江，吕超．2008．中国现代蔬菜病虫原色图鉴．呼和浩特：远方出版社．

戚佩坤，姜子德，向梅梅．2007．中国真菌志．北京：科学出版社．

任锡伦，张汉卿．1993．茄子（Solanum melongenaL.）对褐纹病菌（Phomopsis vexans）抗性的鉴定研究．吉林农业大学学报，15（2）：34-38．

魏景超．1979．真菌鉴定手册．上海：上海科学出版社．

吴仁锋．2011．茄褐纹病的识别与防治．长江蔬菜，（13）：34-35．

中国农作物病虫害编辑委员会．1979．中国农作物病虫害．北京：农业出版社：1403-1405．

周永力，吕国忠，刘伟成，白金铠．1998．球壳孢目真菌个体发育研究Ⅰ：壳二孢等四属．菌物系统，17（3）：199-205．

Studies on Identification of Eggplant Phomopsis Rot Caused by Phomopsis vexans and Its Biological Characteristics

WU Ren-feng，YANG Shao-li，YANG De-zhi
（Wuhan Vegetable Research Institute，Wuhan 430065，Hubei，China）

The morphological characteristics，pathogenicity and biological characteristics of the pathogens isolated from Eggplant phomopsis rot of Wuhan were studied．Large numbers of diseased eggplant samples were collected from different planting areas of Wuhan．Fifteen isolates of possible pathogenic fungi were isolated from leaves，stems and fruits of infected phomopsis rot plants．Based on the pathogenicity experiment，the results showed that the 15 isolates were the pathogens of Eggplant Phomopsis Rot disease．The morphological identification showed that 15 isolates werePhomopsis vexans．The results of studies on biological characteristics of pathogens showed that the optimum culture medium for mycelial growth were PDA and PSA，beneficial to spores culture medium were oats medium，the optimum temperature for mycelial growth were 25-30 ℃，and the optimum pH value were 4-7，and light promoted the growth of mycelial．The pathogen could make use of various carbon and nitrogen sources. Maltose was the best carbon source and sodium nitrate was the best nitrogen source．The lethal temperature for mycelial growth was 55 ℃ for 25 min.

Eggplant；Phomopsis rot；Pathogen identification；Bio1ogical characteristics

S436.411

A

1000-6346（2013）08-0080-06

2012-11-07；接受日期：2012-11-28

武汉市农科院科技创新项目〔武农科政（2011）63号〕

吴仁锋，男，高级农艺师，主要从事蔬菜病害诊断及综合防控方面的研究，E-mail：wuhanwurenfeng@126.com