施污土壤重金属有效态分布及生物有效性

铁 梅，宋琳琳，惠秀娟，张朝红，薛 爽，陈忠林，王 杰，张 莹

(辽宁大学环境学院，沈阳 110036)

城市污泥是城市污水处理过程中的伴生产物，是一种由有机物质残片、细菌菌体、无机颗粒、胶体等组成的极其复杂的非均质体［1］，由于其浓缩了污水中大量的重金属，成为污泥资源化利用的最大障碍［2-3］。污泥中重金属进入土壤后经溶解、沉淀、凝聚、络合、吸附等过程表现出不同的环境效应［4-5］，而仅凭总量信息较难对重金属的环境效应进行准确判断，但重金属的有效态却能更有效的体现重金属在污泥和土壤中的活性和生物有效性［6］。“有效态重金属”主要指土壤中能被植物所吸收与同化的重金属形态［7］。它不仅包括水溶态、酸溶态、螯合态和吸附态，也包括能在短期内释放为植物可吸收利用的某些形态，如某些易分解的有机态和易风化的矿物态等［8］。确定土壤中有效态重金属含量及其对植物吸收重金属量的影响已成为目前研究的热点。进一步研究表明，通过化学溶剂提取法所得重金属有效态量与其产生的生物效应之间的相关性大小，可作为评价土壤重金属短期或中期所存在的危害性［9-10］。段吴燕等［11］和Gupta等［12］研究发现EDTA(乙二胺四乙酸二钠)提取的是土壤中植物可利用态重金属，其含量能较好的评价在一段时间内重金属对植物吸收的影响。也有研究［13-15］表明，中性盐CaCl2(氯化钙)和CH3COONH4(醋酸铵)能对土壤中交换态和水溶态重金属进行有效提取，其提取量与植物可吸收利用重金属含量密切相关。

目前一些国家已采用水溶态和交换态重金属含量来评价不同土壤重金属污染程度大小［10，16］，而我国目前仍利用总量来评价，相对而言对重金属形态的分析与评价研究比较滞后。本研究采用不同性质单一提取剂就污泥混合土壤中重金属的有效态进行提取和分析，以了解污泥中重金属进入土壤后的归趋及对土壤有效态重金属含量的影响，并通过黑麦草对污泥混合土壤中重金属的迁移转化情况来指示其生物有效性和环境效应，从而为污泥资源化利用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 供试土壤、污泥和植物

供试土壤采自辽宁沈阳棕壤土的耕表层土壤(0—20 cm);供试污泥取自沈阳市北部污水处理厂脱水污泥;供试植物为丹麦多年生黑麦草(品种名称:绅士)。

1.2 实验方法

将脱水污泥和土壤在自然条件下风干、研磨过2 mm筛后，将污泥与土壤按照不同质量比均匀混配，分别形成污泥添加率为0%(CK)、9.1%(S1)、16.7%(S2)、28.6%(S3)、37.5%(S4)、44.4%(S5)和 50%(S6)7种污泥混合土壤。将各污泥混合土壤分别放于塑料盆中，室温下定期以定量去离子水多次浇灌浸泡、风干，使其物相达平衡，历时30d后，各留取100g样，研磨过0.15 mm筛后，用于相关指标的测定;另取800g分别装入种植盆中，每组平行3个样品。定量播种黑麦草种子，生长50 d后采样，并将根和叶分开，去离子水洗净干燥备用。

1.3 分析方法

1.3.1 污泥、土壤和各混合样品有机质含量和pH值的测定

采用重铬酸钾氧化-外加热法测定各样品有机质含量;1∶2.5土水比法测定各样品pH值［17］。

1.3.2 污泥、土壤、各混合样品和植物样品中重金属总量的测定

准确称取0.5 g各污泥土壤混合样品置于聚四氟乙烯溶样杯中，加入6 mL浓HNO3，在85—95℃水浴预处理30 min后装入密闭消解罐，置于MDS-2002A型压力自控密闭微波系统中，采用梯度压力消解程序进行消解;消解结束后，取出冷却、定容、过滤，置于4℃保存，每个样品设置3个平行样，并以相同条件做空白样。采用美国Varian公司SpectrAA 220型原子吸收光谱仪测定其含量。

准确称取黑麦草根(0.5 g)和叶(2.0 g)置于溶样杯中，加入5 mL浓HNO3，在85—95℃水浴预处理30 min后再加入1 mL H2O2，装入密闭消解罐中，消解和测定方法同上。

1.3.3 污泥、土壤和各混合样品中不同形态重金属的分离提取

采用6种提取剂分别对各处理样品中螯合态、酸溶态、中性交换态、中性结合态、碱性交换态和蛋白质结合态的重金属进行分离提取，见表1。各样品在室温(25℃)，120 r/min下提取3 h后，4000 r/min下离心20 min，过滤，滤液测定方法同上。

表1 污泥中重金属有效态的提取Table1 The extraction conditions of available form of heavy metals in sludge

1.4 数据统计分析

实验数据采用Origin 7.5作图。采用SPPS13.0统计软件对实验数据进行单因素方差分析，即在平均值(N=3)比较基础上，采用LSD和Duncan方法，在P=0.05或0.01水平进行数据差异显著性检验，以比较不同污泥比例混合基质间各指标的差异显著性，同时利用Person(two-tailed)法进行相关性分析。

2 结果和分析

2.1 不同污泥配比对土壤理化性质的影响

由表2可知，随着污泥添加比例的增加，混合土壤的有机质含量和pH值逐渐增加。污泥的添加对土壤中4种重金属总量影响显著(P＜0.05)，随着污泥添加比例的增加，混合土壤中Cd、Cu和Zn总量显著增加(P＜0.05)，Pb总量增幅较小。

2.2 不同污泥配比对土壤重金属有效态的影响

2.2.1 不同污泥配比对土壤重金属螯合态和酸溶态的影响

由表3可知，污泥中四种重金属螯合态含量均显著大于土壤。污泥的添加促进了土壤中重金属-螯合物的生成，螯合态Zn含量增加最多，其次为Cu和Cd，均在S5组达最大值，分别为223.83、34.57和0.92 mg/kg，较CK分别增加了37.5、3.1和1.1倍;污泥添加对Pb螯合态含量在S6组出现最大值，为39.77 mg/kg，但增幅较小，只较CK增加了0.6倍。污泥混合土壤中四种重金属螯合态存在比例大小表现为Pb＞Zn＞Cd＞Cu。

表2 不同污泥配比对土壤理化性质的影响Table2 Effect of sludge dosage rate on physical and chemical characteristics of soil and contents of heavy metals in soil

表3 不同污泥配比对土壤重金属螯合态和酸溶态含量的影响Table3 Effect of sludge dosage rate on contents of the chelated and acid-soluble forms of heavy metals in soil

利用CH3COOH对污泥混合土壤中酸溶态重金属提取结果如表3所示，污泥中4种重金属酸溶态含量均大于土壤，比例大小表现为Zn＞Cd＞Pb＞Cu。污泥添加对土壤酸溶态Cd、Pb和Zn含量影响显著，酸溶态Cd和Zn含量随污泥添加量的增加而显著增加，在S4组达最大值0.82 mg/kg和110.41 mg/kg，较CK分别增加了3.3和5.1倍，但当污泥添加量继续增加时，酸溶态Cd和Zn含量和比例却有所降低;酸溶态Pb含量和比例与污泥的添加量成正比，在S6组达最大值4.35 mg/kg，较CK增加了2.2倍;污泥的添加使酸溶态Cu含量呈现出先显著升高后显著降低的趋势，存在比例由S1处理的4.5%下降到S5处理的0.8%。

2.2.2 不同污泥配比对土壤重金属中性交换态和结合态的影响

采用中性盐CaCl2对污泥混合土壤中性交换态重金属进行提取。结果由表4可知，污泥的添加对土壤中性交换态Cd和Pb含量和比例影响不显著，各污泥混合土壤中性交换态Cd、Cu和Pb含量分别在0.3、0.7 mg/kg和1.2 mg/kg以下，且中性交换态Cu和Pb比例低于0.4%和1.3%。施污土壤中性交换态Zn含量未检出。

CH3COONH4在溶液pH值呈中性时可提取介质中以中性结合态存在的重金属。由表4可看出，污泥混合土壤中4种重金属中性结合态比例大小为Cd＞Zn＞Pb＞Cu。污泥的添加对中性结合态Cd含量影响不显著(均在0.25 mg/kg以下)，而中性结合态Pb、Cu和Zn含量有所增加，分别在1.13—3.03 mg/kg、0.90—2.10 mg/kg和6.62—12.19 mg/kg之间，但对土壤中性结合态Pb和Cu比例的变化率却在1.4%和0.7%以下。

表4 不同污泥配比对土壤重金属中性交换态和结合态含量的影响Table4 Effect of sludge dosage rate on contents of the neutral exchange and neutral bound forms of heavy metals in soil

表5 不同污泥配比对土壤重金属碱性交换态和蛋白质结合态含量的影响Table5 Effect of sludge dosage rate on contents of the alkali-soluble and protein-binding forms of heavy metals in soil

2.2.3 不同污泥配比对土壤重金属碱性交换态和蛋白质结合态的影响

NaHCO3提取的是污泥混合土壤中以碱性交换态形式存在的重金属。由表5可看出，污泥的添加对土壤碱性交换态Pb和Cu含量影响较小，分别介于0.24—0.41 mg/kg和1.02—2.45 mg/kg之间，存在比例分别低于0.8%和2%;污泥添加虽促进了碱性交换态Zn的溶出，但其含量也仅在0.11—1.55mg/kg之间，比例低于0.3%。而在碱性环境中，Cd活性要高于其他3种重金属的活性。

采用Tris-HCl缓冲液对污泥混合土壤中重金属在碱性条件下可溶性蛋白态组分进行提取。结果表明，污泥的添加对土壤中四种重金属的蛋白质结合态含量影响不显著，其存在比例均在1%以下。

2.3 污泥添加对黑麦草体内重金属含量的影响

图1结果表明，污泥的添加显著促进了黑麦草根部对Cd、Cu和Zn的吸收(P＜0.05)，在S5组吸收量达最大，分别为9.65 mg/kg、101.09 mg/kg和976.90 mg/kg，较CK增加了0.3、2.3和6.5倍;而黑麦草根部对Pb的吸收量却随污泥添加量的增加显著下降(P＜0.05)，在S4组时达22.79 mg/kg，是CK的0.6倍。

黑麦草叶部的重金属含量显著低于根部重金属含量。污泥的添加显著增加了叶部对Cu和Zn的吸收;当污泥以较低比例(S1—S3)添加到土壤中时，叶部对Cd和Pb的吸收量与CK间无显著差异(P＜0.05)，而以较高污泥比例添加(S4—S6)时，叶部对Cd的吸收量虽与CK之间差异显著 (P＜0.05)，但各处理之间的差异并不显著，而叶部Pb含量却随污泥添加量的增加而显著降低。

图1 不同污泥配比处理下黑麦草根和叶的重金属含量Fig.1 The heavy metal contents in leaves and roots of ryegrass grown in soil with different sludge dosage rates

2.4 重金属的生物有效性与施污土壤有效态重金属的相关关系

通过对污泥混合土壤中重金属各有效态含量与植物体内重金属吸收量间的相关性大小进行比较可知(表6)，黑麦草体内对Cd吸收量仅与土壤中螯合态和酸溶态Cd含量存在显著正相关，相关性大小为螯合态＞酸溶态;草体对Zn吸收量受土壤中螯合态、酸溶态和中性结合态和碱性交换态Zn含量影响显著，相关性大小顺序为螯合态＞中性结合态＞碱性交换态＞酸溶态;对Cu吸收量除与土壤酸溶态Cu含量相关性不显著外，与其它形态Cu含量呈显著正相关，相关性大小表现为螯合态＞中性结合态＞中性交换态＞碱性交换态＞蛋白质结合态;但草体对Pb吸收量却与各形态Pb含量均呈显著负相关。

3 讨论

土壤中的重金属可与土壤中不同组分相结合呈现出不同的化学形态，对环境产生不同的生态效应［18］。当外源物质(例如污泥)进入土壤中时，能够引起土壤中诸如有机质类等物质组成发生变化，从而影响重金属在土壤环境中的存在形态、迁移转化趋势和生物有效性［19］。本研究采用6种不同性质提取剂对污泥混合土壤中有效态重金属的提取结果可看出，施污土壤中Cd、Pb、Cu和Zn以螯合态存在比例较大，说明污泥进入土壤后，在降解过程中会产生大量的有机酸类物质，改变了土壤的表面性质，提供了更多的吸附点位，有助于重金属-溶解性配合物和螯合物的形成。而EDTA可在一定程度上模拟土壤中有机酸类物质，在螯合作用下，其有机配体与重金属离子竞争土壤中的吸附点位，将土壤中固态重金属释放出来。但污泥的施入对土壤4种重金属螯合态的含量和存在比例影响有显著性的差异。螯合态Zn含量和比例增幅最大，而对螯合态Cu影响却较小，这可能是因为污泥的施入对土壤有机质含量增加的同时，也使更多的Cu2+与土壤中生物大分子有机官能团(主要是羧基、羰基和酚基等)形成稳定的配位化合物，由于Cu的配合物溶度积较小，进而影响到Cu的生物活性，抑制了可溶性Cu的形成，这与Gupta等［4］和Nomeda等［20］的研究结果一致。研究发现，污泥的添加能够显著提高土壤中酸溶态Cd、Pb和Zn的含量，却使其占总量的比例下降，这与污泥中酸溶态重金属存在比例较低有关。酸溶态重金属存在比例低于螯合态重金属存在比例是因为土壤环境中不同种类有机酸作为配体时与重金属络合强度存在差异。

表6 黑麦草体内重金属含量与各形态重金属含量的相关性Table6 Correlation coefficient between the heavy metal contents and the contents of different forms of heavy metals in ryegrass

从表3、表4和表5来看，土壤溶液的pH值不仅决定了各种土壤矿物的溶解度，而且也影响着土壤溶液中各种离子在固相表面的吸附程度。当土壤溶液pH值呈酸性时，有助于溶解性金属配合物和螯合物的生成，增强了重金属的移动性和生物有效性;土壤溶液pH值在中性条件时，有效态重金属的提取量却显著低于螯合态和酸溶态;而溶液在碱性条件下，更不利于重金属有效态的析出。这是因为当周围土壤溶液环境pH值呈碱性时，重金属会与施污土壤中溶解度较低的氢氧化物、碳酸盐、磷酸盐等结合的能力增加，而使得重金属阳离子的交换能力降低，抑制了重金属的活性和迁移能力。

探究施污土壤中重金属有效态的含量与植物实际吸收重金属量的相关性能够更好的表征土壤中重金属的植物可利用性［21］。实验结果表明，黑麦草体内Cd含量与施污土壤中螯合态和酸溶态Cd含量密切相关;草体Zn含量与施污土壤中螯合态、酸溶态和中性结合态Zn含量相关性显著;草体内Cu含量与施污土壤螯合态、中性结合态Cu含量之间存在显著相关性;黑麦草Pb含量也与施污土壤酸溶态和中性结合态Pb含量密切相关。Žemberyová［22］和Merrs等［23］通过探究污泥和土壤中有效态重金属含量可知，EDTA可提取土壤中交换态和碳酸盐结合态的金属，并将其转化为水溶态，参与植物对重金属的吸收、运输等生理代谢过程;醋酸作为低分子量有机酸能够模拟土壤的根际环境，更好的体现重金属生物有效性。本研究采用土壤中重金属螯合态和酸溶态的含量和比例来表征不同重金属的有效性大小，依次分别为Zn＞Cu＞Cd＞Pb、Zn＞Cd＞Cu＞Pb。而在酸性条件下，重金属有效性大小存在差异是因为重金属离子与不同配体形成的配合物与土壤表面结合能力大小不同，以及配合物在离解过程不同重金属离解常数的差异共同影响了重金属的有效性。通过相关性分析结果还可看出草体对Pb吸收量与各形态Pb含量均呈显著负相关，说明污泥的添加虽使土壤中各形态Pb含量增加，但植物根系分泌的有机酸类物质使得根际周围土壤中Pb形态发生了重构，形成溶解度较小的PbCO3和 PbSO4等沉淀物，抑制了植物对Pb吸收和迁移，钝化了Pb的活性，此研究结果与王兆炜等［24］一致。

目前，污泥的土地施用被认为是一种使自然资源循环的理想方法，将一定量的污泥施用于土壤中能够增加土壤中有机质含量并改善土壤肥力，但同时也改变了土壤中重金属的含量和生物有效性。就本研究而言，污泥的施入对土壤中螯合态和酸溶态Cd、Cu和Zn的含量影响较大，而对中性和碱性条件下的有效态重金属起到一定的钝化作用，不利于重金属的溶出。因此，将污泥施用于中性和碱性的土壤中时，能够固化污泥中重金属的活性，限制其向植物和环境的迁移，增加污泥施用的安全性。

［1］ MacNicol R D，Beckett P H T.The distribution of heavy metals between the principal components of digested sewage sludge.Water Research，1989，23(2):199-206.

［2］ Bai L P，Fu Y P.Research progress of the application of urban sewage sludge to terrestrial ecosystems.Acta Ecologica Sinica，2009，29(1):416-426.

［3］ Ahumada I，Gudenschwager O，Carrasco M A，Castillo G.Copper and zinc bioavailabilities to ryegrass(Lolium perenne L.)and subterranean clover(Trifolium subterraneum L.)grown in biosolid treated Chilean soils.Journal of Environmental Management，2009，90(8):2665-2671.

［4］ Gupta A K，Sinha S.Chemical fractionation and heavy metal accumulation in the plant of Sesamum indicum(L.)var.T55 grown on soil amended with tannery sludge:selection of single extractants.Chemosphere，2006，64(1):161-173.

［5］ Karvelas M，Katsoyiannis A，Samara C.Occurrence and fate of heavy metals in the wastewater treatment process.Chemosphere，2003，53(10):1201-1210.

［6］ Pueyo M，López-Sánchez J F，Rauret G.Assessment of CaCl2，NaNO3and NH4NO3extraction procedures for the study of Cd，Cu，Pb and Zn extractability in contaminated soils.Analytica Chimica Acta，2004，504(2):217-226.

［7］ Koo B J，Chen WP，Chang A C，Page A L，Granato T C，Dowdy RH.A root exudates based approach toassess the long-termphytoavailability of metals in biosolids-amended soils.Environmental Pollution，2010，158(8):2582-2588.

［8］ Liu L，Gao X H，Song C Y，Li F S.Progress in the study of Cadmium occurrence and transportation in soils.Energy Environmental Protection，2006，20(2):6-9.

［9］ Chu Z D，Zhang G Y，Xue P Y，Xu G M，Bi SQ.Comparison of available Pb，Cd results extracted by different extractions in rhizosphere and non-rhizosphere soils.Chinese Agricultural Science Bulletin，2008，24(4):298-302.

［10］ Meers E，Samson R，Tack F M G，Ruttens A，Vandegehuchte M，Vangronsveld J，Verloo M G.Phytoavailability assessment of heavy metals in soils by single extractions and accumulation by Phaseolus vulgaris.Environmental and Experimental Botany，2007，60(3):385-396.

［11］ Duan W Y，Ding Y，Shu H Y，Liao S Y，Yuan Y，Zeng T.Optimization on characterization method of heavy metal plant availability in yellow brown soil.Journal of Anhui Agricultural Science，2009，37(4):1760-1762.

［12］ Gupta A K，Sinha S.Assessment of single extraction methods for the prediction of bioavailability of metals to Brassica juncea L.Czern.(var.Vaibhav)grown on tannery waste contaminated soil.Journal of Hazardous Materials，2007，149(1):144-150.

［13］ Sahuquillo A，Rigol A，Rauret G.Overview of the use of leaching/extraction tests for risk assessment of trace metals in contaminated soils and sediments.Trends in Analytical Chemistry，2003，22(3):152-159.

［14］ Houba V JG，Temminghoff E J M，Gaikhorst G A，Vark W V.Soil analysis procedures using 0.01M calcium chloride as extraction reagent.Communications in Soil Science and Plant Analysis，2000，31(9/10):1299-1396.

［15］ Gommy C，Perdrix E，Galloo J C，Guillermo R.Metal speciation in soil:extraction of exchangeable cations from a calcareous soil with a magnesium nitrate solution.International Journal of Environmental Analytical Chemistry，1998，72(1):27-45.

［16］ Sahuquillo A，López-Sánchez JF，Rubio R，Rauret G，Thomas RP，Davidson CM，Ure A M.Use of a certified reference material for extractable trace metals to assess sources of uncertainty in the BCR three-stage sequential extraction procedure.Analytica Chimica Acta，1999，382(3):317-327.

［17］ Zhang X F.Practical Analysis of Agricultural.Beijing:Chemical Industry Press，2005:112-165.

［18］ Zhi Y B，Wang Z L，Ma Z，Wang Z S，Deng Z F，Li H L.The speciation and bioavailability of heavy metals pollutants in soil along highway in Erdos.Acta Ecologica Sinica，2007，27(5):2030-2039.

［19］ Zhou L X，Shen Q R.ChenT B，Zhang S.Distribution and chemical form of heavy metals in the principal components of undigested sludge.Acta Scientiae Circumstantiae，2000，20(3):269-274.

［20］ Nomeda S，Valdas P，Chen S Y，Lin J G.Variations of metal distribution in sewage sludge composting.Waste Management，2008，28(9):1637-1644.

［21］ Wang J，Zhang C B，Ke S S，Liu W L，Qian B Y.Effects of sewage sludge amendment on physico-chemical properties of mine tailings and physiological responses of Cinnamomun camphora.Acta Ecologica Sinica，2010，30(10):2593-2602.

［22］ Žemberyová M，Barteková J，Závzdská M，Šišoláková M.Determination of bioavailable fractions of Zn，Cu，Ni，Pb and Cd in soils and sludges by atomic absorption spectrometry.Talanta，2007，71(4):1661-1668.

［23］ Meers E，Laing G D，Unamuno V，Ruttens A，Vangronsveld J，Tack F M G，Verloo M G.Comparison of cadmium extractability from soils by commonly used single extraction protocols.Geoderma，2007，141(3/4):247-259.

［24］ Wang Z W，Nan Z R，Zhao CJ，Wang SL，Wu WF，Liao Q.Charateristics of heavy metal's uptake and accumulation by celery under single and combined pollution of Cd and Pb in arid oasis soils.Chinese Journal of Soil Science，2011，42(5):1256-1262.

参考文献:

［2］ 白莉萍，伏亚萍.城市污泥应用于陆地生态系统研究进展.生态学报，2009，29(1):416-426.

［8］ 刘俐，高新华，宋存义，李发生.土壤中镉的赋存行为及迁移转化规律研究进展.能源环境保护，2006，20(2):6-9.

［9］ 褚卓栋，张桂银，薛培英，徐国明，毕淑芹.根际和非根际土壤有效铅镉的浸提剂筛选.中国农学通报，2008，24(4):298-302.

［11］ 段吴燕，丁园，舒红英，廖世玉，袁勇，曾涛.黄棕壤重金属植物可利用性表征方法的优化.安徽农业科学，2009，37(4):1760-1762.

［17］ 张行峰.实用农化分析.北京:化学工业出版社，2005:112-165.

［18］ 智颖飙，王再岚，马中，王中生，邓自发，李红丽.鄂尔多斯地区公路沿线土壤重金属形态与生物有效性.生态学报，2007，27(5):2030-2039.

［19］ 周立祥，沈其荣，陈同斌，章申.重金属及养分元素在城市污泥主要组分中的分配及其化学形态.环境科学学报，2000，20(3):269-274.

［21］ 王江，张崇邦，柯世省，刘文莉，钱宝英.添加污泥对尾矿砂理化性质及香樟生理特性的影响.生态学报，2010，30(10):2593-2602.

［24］ 王兆炜，南忠仁，赵转军，王胜利，武文飞，廖琴.干旱区绿洲土壤Cd、Pb单一与复合污染下芹菜重金属累积特征研究.土壤通报，2011，42(5):1256-1262.