气相色谱法同时测定白酒中甲醇和乙（己）酸乙酯

2013-09-07李超豪向乐曦杨春林

食品与机械 2013年1期

李超豪胡强吴蔚向乐曦杨春林

（乐山市产品质量监督检验所，四川乐山 614000）

白酒的主要成分是乙醇、水（占总量的98%～99%），以及作为白酒呈香呈味物质的酸、酯、醇、醛等种类众多的微量有机化合物（占总量的1%～2%）。其中，乙酸乙酯和己酸乙酯在香气成分的构成方面占据着重要地位，决定了酒品的优良等级，中国 GB／T 10781.1——2006《浓香型白酒》和 GB／T 10781.2——2006《清香型白酒》标准明确规定了其界限含量范围。除了呈香呈味物质，白酒在发酵过程中还会产生微量的甲醇、杂醇油等对人体有害的物质，甲醇饮用过量会引起双目失明，严重者导致死亡［1］，因此其含量为 GB 2757——1981《蒸馏酒及配制酒卫生标准》标准严格控制。甲醇、乙酸乙酯和己酸乙酯作为酒类检测的重要指标，准确地定性、定量尤为必要。

目前，甲醇检测方法依据 GB／T 5009.48——2003《蒸馏酒及配制酒卫生标准的分析方法》，该方法分为碱性品红亚硫酸比色法和气相色谱法。郐仲霞等［2］报道，碱性品红亚硫酸比色法操作繁琐、耗时长；气相色谱法快速、高效、准确，但中国国家标准还仍然要求采用分离效果较差的GDX－102填充柱。乙酸乙酯和己酸乙酯检测方法依据GB／T 10345——2007《白酒分析方法》，采用LZP－930柱，属PEG型柱。据报道［3］，PEG、FFAP和 HP－INNO－Wax等色谱柱，能分离白酒中众多物质，但未能对性质极为相似的乙酸乙酯和乙缩醛进行有效地分离。本试验通过DB－WAX柱和LZP－930白酒分析专用柱的分析比较、色谱条件的优化，实现乙酸乙酯与乙缩醛分离，建立了白酒中同时检测甲醇（外标法）、乙酸乙酯和己酸乙酯（内标法）的毛细管气相色谱分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白酒：市售；

甲醇：色谱纯，美国Tedia公司；

乙酸乙酯、己酸乙酯、乙酸正戊酯标准品：天津市化学试剂研究所；

乙醇（四无乙醇）：分析纯，天津科密欧试剂有限公司。用超纯水配制成60%乙醇溶液；

试验用水：均为超纯水，本实验室自制。

1.2 仪器与设备

气相色谱—质谱联用仪（配有FID氢火焰检测器、AOC－20i自动进样器）：GCMS－QP2012S型，日本岛津公司；

超纯水装置：Milli－Q型，美国Millipore公司。

色谱柱：Agilent DB－WAX 型（30m × 0.32mm ×0.25μm），美国安捷伦公司；

白酒分析专用柱：LZP－930型（25m ×0.32mm ×1μm），中国科学院兰州化学物理研究所。

1.3 气相色谱条件

1.3.1 DB－WAX色谱柱的色谱条件进样口温度220℃；检测器温度220℃；柱流速1.60mL／min；载气为氦气（纯度99.999%），载气流速30mL／min，H2流速40mL／min，Air流速400mL／min，尾吹流速30mL／min；采用分流进样方式，分流比35∶1，进样量1μL。程序升温条件：初始温度30℃，保持4min，以5℃／min升至60℃，再以10℃／min升至180℃，保持1min。

1.3.2 LZP－930白酒分析专用柱的色谱条件进样口温度220℃；检测器温度220℃；柱流速1.80mL／min；载气为氦气（纯度 99.999%），载气流速 30mL／min，H2流速40mL／min，Air流速400mL／min，尾吹流速30mL／min；采用分流进样方式，分流比30∶1，进样量1μL。程序升温条件：初始温度35℃，保持3min，以5℃／min升至124℃，再以15℃／min升至180℃，保持3.6min。

1.4 标准溶液的配制

分别称取甲醇1.013 8g、乙酸乙酯3.012 7g、己酸乙酯3.999 7g于100mL容量瓶中，用60%乙醇溶液稀释至刻度，配制成浓度为甲醇10.138g／L、乙酸乙酯30.127g／L、己酸乙酯39.997g／L的混合标准储备液。

准确称取乙酸正戊酯2.000g于100mL容量瓶中，用60%乙醇溶液稀释至刻度，配制成浓度为20.000g／L内标物标准溶液。

分别吸取0.10，0.50，1.00，2.00，4.00，6.00，8.00mL的混合标准储备液于100mL容量瓶中，逐一加入1.00mL的乙酸正戊酯内标物标准溶液，用60%乙醇溶液稀释至刻度，配制成系列混合标准工作液。

1.5 样品的处理

取适量白酒于10mL容量瓶中，加入100μL乙酸正戊酯内标溶液，用白酒定容至刻度，供上机分析使用。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的探讨

目前，白酒研究大多使用DB－WAX柱、FFAP柱或HPINNO－Wax柱等类型的色谱柱，都使用以极性键交链或键合的固定相，能够有效地分离白酒中大多数的物质［3］。据报道［4－6］，FFAP柱无法实现乙酸乙酯和乙缩醛的分离，HPINNO－Wax柱和部分PEG柱上乙酸乙酯和乙缩醛分离度较差。

试验选用LZP－930白酒分析专用柱和DB－WAX柱进行对比。由图1和图2可知，乙酸乙酯、乙缩醛在两种色谱柱上均能分离，但由于DB－WAX柱对低沸点分析物的分辨率更高，乙酸乙酯、乙缩醛在DB－WAX柱的分离度明显高于LZP－930柱。虽然如此，LZP－930柱仍能以峰高定量乙酸乙酯来解决分离度不佳造成的影响，DB－WAX柱则能以峰面积来定量，较以峰高定量更为准确。在加入相同浓度内标物的情况下，内标物在LZP－930柱的响应值不足DB－WAX柱的1／2，说明DB－WAX柱的检测灵敏度高于LZP－930白酒分析专用柱，即检出限更低。酒样在LZP－930柱上30min内完成分析，而DB－WAX柱只需15min，提高了1倍的分析效率。由图3和图4可知，在LZP－930柱上，甲醇出峰时基线突然升高，乙酸乙酯出峰点在乙醇的拖尾峰上，影响了甲醇和乙酸乙酯定量准确性。而DB－WAX柱基线平稳，乙酸乙酯在乙醇之前出峰，避免了高浓度乙醇峰的干扰，定量更为准确。本方法最终选择DB－WAX柱作为分析柱。

图1 白酒中甲醇、乙酸乙酯、乙缩醛、己酸乙酯在DB－WAX色谱柱上的分离色谱图Figure 1 Chromatogram of Methanol，Ethyl Acetate，Acetal and Ethyl Caproate in liquor on DB－WAX

图2 白酒中甲醇、乙酸乙酯、乙缩醛、己酸乙酯在LZP－930色谱柱上的分离色谱图Figure 2 Chromatogram of Methanol，Ethyl Acetate，Acetal and Ethyl Caproate in liquor on LZP－930

图3 甲醇、乙酸乙酯在LZP－930柱上的色谱峰图Figure 3 Chromatogram of Methanol，Ethyl Acetate on LZP－930

图4 甲醇、乙酸乙酯在DB－WAX柱上的色谱峰图Figure 4 Chromatogram of Methanol，Ethyl Acetate on DB－WAX

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 柱温、升温速率的选择柱温、升温速率直接影响待测组分的保留时间、分离度及峰形。试验最初选用50℃为初始温度、5℃／min的升温速率、流速1.5mL／min、分流比20∶1、载气为氮气的初始条件，结果发现乙酸乙酯、乙缩醛、甲醇色谱峰部分重叠。考虑到3种组分都具有低沸点特性，初始温度过高造成了3种组分同时流出，故保持其它条件不变，采用30，35，40℃初始温度进行比较。由表1可知，初始温度为30℃，保持4min，乙酸乙酯、乙缩醛、甲醇色谱峰分离度有显著提高。在程序升温的高温部分，升温速率采用10℃／min，加快了己酸乙酯出峰速度，且无杂峰干扰，有效地缩短了分析时间。

表1 乙酸乙酯、乙缩醛、甲醇在不同初始温度下的分离度Table 1 Recolution of Methanol，Ethyl Acetate and Acetal on different initial temperature

2.2.2 柱流速的选择 DB－WAX毛细管柱为0.32mm细内径，柱流速过慢，会导致峰型增宽、拖尾，同时延长分析时间；柱流速过快，虽能缩短分析时间，但各组分不能完全分离，致使色谱峰重叠［7］。试验采用 1.2，1.4，1.6，1.8，2.0mL／min柱流速（表2）。结果显示，流速对各组分的分离影响不大，柱流速为1.6mL／min时，乙酸乙酯、乙缩醛、甲醇、己酸乙酯分离良好，峰形最为尖锐。

表2 乙酸乙酯、乙缩醛、甲醇在不同柱流速下的分离度†Table 2 Recolution of Methanol，Ethyl Acetate and Acetal on different column flow

2.2.3 分流比的选择适当的分流比可改善峰形的对称性、峰宽大小，有效提高组分间的分离度，但峰形的改善会以降低灵敏度为代价，并会增大主体成分的歧化反应［8］。试验分别设置分流比为20∶1、35∶1、50∶1（表3）。结果表明，随着分流比的增加，各组分的峰形逐步变得尖锐，信号响应值逐步降低。当分流比35∶1时，乙酸乙酯、乙缩醛、甲醇分离效果好，且各组分响应值较高。

表3 乙酸乙酯、乙缩醛、甲醇在不同分流比下的分离度†Table 3 Recolution of Methanol，Ethyl Acetate and Acetal on different split retio

2.2.4 载气的选择通常情况下，FID检测器载气为氢气、氦气、氮气3种。氢气分子量小，黏度小，有较大的线速度调节范围，分离效率最高，但在实际应用中存在很大安全隐患，因此试验选择选用氮气、氦气进行对比（表4）。结果发现，氦气作为载气时，乙酸乙酯和乙缩醛峰形尖锐对称，并且得到完全分离；而氮气作为载气时，乙酸乙酯和乙缩醛峰有部分重叠。这是由于氮气线速度过高会损失峰分离度和峰形［9］，乙酸乙酯和乙缩醛的本身性质决定了需要较高的分离度，氦气具有与氢气相当的分离效率和线速度调节范围，且化学性质稳定，柱效高，所以使用效果更为理想。

表4 乙酸乙酯、乙缩醛、甲醇在不同载气下的分离度†Table 4 Recolution of Methanol，Ethyl Acetate and Acetal on different carrier gas

2.3 定量方法、线性检测范围及方法检出限

2.3.1 定量方法的选择本方法乙酸乙酯、己酸乙酯采用内标法定量，选用乙酸正戊酯为内标。内标法能够有效地降低仪器稳定性及试验环境所带来的定量误差。而内标物应为与待测组分性质相似、化学性质稳定且检测样品中不含有的物质，乙酸正戊酯不能作为甲醇的内标物，故甲醇采用外标法定量。

2.3.2 线性检测范围及方法检出限在选定的色谱条件下，对系列混合标准工作液进样后绘制标准曲线。甲醇采用外标法定量，以系列浓度为横坐标，以目标化合物峰面积为纵坐标，进行线性回归计算；乙酸乙酯、己酸乙酯采用内标法定量，以系列浓度与内标物浓度比为横坐标，以目标化合物峰面积与内标物峰面积比为纵坐标，进行线性回归计算。以信噪比（S／N ＝3）为方法检出限，回归方程、相关系数、线性范围及检出限见表5。结果表明，3种组分在其线性范围内呈良好的线性关系，相关系数均大于0.999 5。

2.4 方法的精密度试验

方法的精密度以测定待测组分含量的相对标准偏差（RSD）来评价。将含有甲醇、乙酸乙酯和己酸乙酯的白酒样品重复测定6次，计算相对标准偏差（RSD）见表6。结果表明，各组分相对标准偏差（RSD）在0.3%～0.7%，本方法具有良好的精密度。

表5 各组分回归方程、相关系数、线性范围及方法检出限Table 5 Standard curves，correlation coefficients，detection limits of components

表6 方法精密度Table 6 Precision tests（n ＝6）

2.5 回收率试验

方法的准确度是通过待测组分在不同浓度下的回收率来评价。对白酒样品进行低、中、高3个添加水平回收率试验（见表7）。结果表明，各组分的回收率在94.3%～98.9%，本方法的测定结果准确可靠。

3 结论

本试验建立了白酒中甲醇、乙酸乙酯和己酸乙酯的毛细管气相色谱检测方法。通过比较DB－WAX柱和LZP－930白酒分析专用柱、优化色谱条件，乙酸乙酯与其干扰物乙缩醛在LZP－930白酒分析专用柱上有部分重叠，适合以峰高定量；而DB－WAX柱则达到完全分离，以峰面积定量提高了准确性。

中国国家标准中甲醇采用 GB／T 5009.48——2003《蒸馏酒与配制酒卫生标准的分析方法》，乙酸乙酯和己酸乙酯采用 GB／T 10345——2007《白酒分析方法》，本方法结合了外标法和内标法，同时检测了白酒中甲醇、乙酸乙酯和己酸乙酯，并选用DB－WAX柱在15min内完成样品分析，有效地缩短了分析时间，提高了日常工作效率。