猪苓硒多糖连续合成工艺及抑菌性能研究

李志洲 刘军海 王俊宏 邓百万 李丽华

（1.陕西理工学院化学与环境科学学院，陕西 汉中 723000；2.陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西 汉中 723000）

猪苓（Polyporus um bellatus（pers.）fries），又名猪茯苓，属于无隔担子菌纲、无褶菌目、多孔菌科、多孔菌属。猪苓味甘、气淡、性平，归肾、膀胱经，有利水渗湿之功效［1］。研究［2］表明，猪苓除了有利尿的作用外还有抗衰老、抗肿瘤、保肝、免疫调节、抗辐射、抗诱变和抗菌等药理作用；猪苓中主要活性成分猪苓多糖是一种非特异性细胞免疫刺激剂，具有抗衰老、提高免疫力、治疗乙型肝炎及抗肿瘤等作用。猪苓的药用价值越来越受到人们的重视。

微量元素硒是生命体活动的重要活性元素之一，主要以有机硒的形态存在。研究资料［3－7］表明，无机硒因具有蓄积毒性和致突变等作用，且使用时剂量因生命体自身特征差异等难以控制，使得硒的应用受到很大限制；而有机硒却相反，毒性低、对生命体副作用小，不但可以更好地发挥硒的作用，而且在激发免疫反应上比无机硒更显著；多糖也是生命体活动的重要活性成分之一，如将无机硒与多糖有机结合使之转化为有机硒化合物——硒多糖，不仅会使硒和多糖的生理和药理功能得到优化，更易于为机体吸收和利用。目前硒多糖的制备主要通过以下3种方法来获得［4，5］：① 生物转化法；② 化学合成法［8，9］；③ 从天然富硒产物中提取。从目前已有的富硒多糖的研究成果［10，11］看，其工艺大多采用间歇式，生产周期长，原料耗损大，经济成本高。本课题采用化学合成法，通过连续式合成的工艺设计，研究猪苓硒多糖连续合成的工艺条件，并对合成的产品进行抑菌性能研究，旨在为猪苓硒多糖规模化生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

猪苓多糖：参考文献［12］制备。

纯净水：汉中天露纯净水厂；

乙醇、亚硒酸钠、无水乙醇、邻苯二铵、乙二胺四乙酸二钠、浓盐酸、氯化钡、浓硝酸：分析纯，西安化学试剂厂；

大 肠 杆 菌 （Escherichia coli）、 金 黄 色 葡 萄 球 菌（Staphylococcus aureus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：陕西省防汉中市防疫站提供。

1.2 主要仪器

紫外分光光度计：Cary－50型，美国瓦里安中国有限公司；

离心机：LD5－10型，北京京立仪器有限公司；

超声清洗仪：LC－300B型，山东济宁鲁超超声设备有限公司；

隔水式电热恒温培养箱：BG－50型，上海昨非实验室设备有限公司；

电热恒温水浴锅：DZKW－D－4型，上海科恒实业发展有限公司；

霉菌培养箱：MHP－250型，上海三发科学仪器有限公司；

电热恒温鼓风干燥箱：DHG－9070A型，上海精宏实验设备有限公司；

立式压力蒸汽灭菌器：LS－C50L型，南昌高腾科技有限公司；

医用工作台：YJ型，上海将来实验设备有限公司；

旋涡混合仪：QT－1型，上海琪特分析仪器系统有限公司；

电子分析天平：FA2204B型，上海精密科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 猪苓硒多糖的分析与合成

（1）硒标准曲线：参照文献［13］所述方法，分别配制浓度为4，20，36，52，68，84，100，116μg／mL的亚硒酸钠标准溶液25mL，各取10mL，用1mol／L的 HCl溶液调pH至2，再加5%的EDTA溶液2mL和1%邻苯二胺试液2mL，振摇，放置2h。取10mL纯净水添加 HCl调pH至2，加2mL邻苯二铵摇匀后作为参比液。待显色完全后，取标准液1mL用紫外可见分光光度计在335nm处测定其吸光度，绘制标准曲线，得回归方程：

式中：

x—— 亚硒酸钠的浓度，μg／mL；

y—— 吸光度。

（2）猪苓硒多糖配合物制备流程：将猪苓多糖与氯化钡混合液（浓度均为0.2mg／mL）和亚硒酸钠溶液（浓度为0.2mg／mL）连续加入反应器中，加入一定量的浓硝酸，控制反应条件进行猪苓硒多糖的配合反应，反应液通过泵打入截留分子量为10 000的中空膜分离装置进行浓缩，浓缩液加入无水乙醇使得混合液中乙醇浓度达80%（V／V），醇析，并静置30min，离心过滤，将所得滤渣烘干，得到产品。

（3）样品中硒含量的测定：待反应稳定后，精密量取反应器流出溶液100mL，加入无水乙醇调节乙醇浓度为90%，使溶液中硒多糖及未反应多糖絮凝，沉降30min后离心，将沉淀物用95%乙醇溶液洗涤3次，每次20mL，弃去洗涤液，沉淀物用蒸馏水溶解并定容至100mL，取10mL溶液用1mol／L的 HCl溶液调pH至2，再加5%的 EDTA溶液2mL和1%邻苯二胺试液2mL，振摇，放置2h；以10mL纯净水作同样操作后作为参比液。用紫外分光光度法在波长为335nm处分别测其吸光度，利用标准曲线的回归方程进行计算得到硒浓度。然后按式（2）计算合成率：

式中：

y—— 合成率，mg／g；

c1—— 取样中硒的浓度，mg／mL；

c2——根据两股原料液流量配比将猪苓多糖折合为反应釜中猪苓多糖的浓度，mg／mL；

v—— 取样体积，mL；

n——稀释的倍数。

1.3.2 抑菌活性研究方法 采用滤纸片法测定［14］。

（1）培养基的制备：按参考文献［14］所述方法制备细菌、真菌和酵母菌种的培养基。

（2）菌悬液的制备：将4种供试菌种分别接入对应的斜面培养基进行活化，操作条件：细菌置于37℃恒温培养箱中活化24h，真菌和啤酒酵母置于28℃恒温培养箱中活化48h。精挑菌苔于9mL无菌生理盐水中，振荡摇匀，制成一系列菌悬液（106～108CFU／mL 的菌悬液［15］），备用。

（3）猪苓多糖及其硒多糖供试液的制备：精密称取两种多糖各2.5g，加蒸馏水溶解并定容至50mL，120℃灭菌20min，冷却后作为贮备液于4℃冰箱中保存，备用。取14支干燥无菌带有棉塞的5mL的小试管，分两组，每组7管；在无菌条件下每管加入1mL无菌蒸馏水，然后取猪苓硒多糖贮备液1mL加入第1管中，摇匀，吸取1mL加入第2管中，依次稀释至第6管，将6管中多余的1mL溶液弃去，第7支试管作为空白对照管，分别得到浓度为25，12.5，6.25，3.125，1.563，0.781mg／mL的猪苓硒多糖供试液；另7管用来制备猪苓多糖供试液，其制备方法类同。

（4）滤纸片的制备：将定性滤纸用打孔器加工成直径为6mm的圆形纸片，置入干燥的平皿中干热灭菌30min后，再浸入猪苓多糖和猪苓硒多糖的供试液中浸泡30min，使其充分吸收。

（5）抑菌试验：将固体培养基熔化倒入平皿，冷却待凝固后，分别加入0.2mL供试菌液，均匀涂布，做成含菌平板；用灭菌镊子夹出含有多糖的滤纸片置于培养基上，平均每皿贴4片，每种菌株做6次重复。细菌置37℃恒温培养箱中倒置培养24h，霉菌及酿酒酵母置28℃恒温培养箱中培养48h，取出，测量滤纸片测定抑菌圈的直径大小，比较抑菌效果，确定最适抑菌浓度。并以无抑菌圈或抑菌效果不明显（D＜6.20mm）对应的稀释浓度为最低抑菌浓度（MIC）。

2 结果与讨论

2.1 连续式反应工艺的设计

本试验设计的连续式反应流程见图1。

图1 连续式反应系统示意图Figure 1 The schematic diagram of homemade continuous reaction system

2.2 硒多糖的合成

2.2.1 单因素试验结果及其分析 影响猪苓硒多糖合成率的因素很多，如猪苓多糖进料流量、硝酸量、反应温度、反应物配比、超声波频率、多糖浓度、亚硒酸钠浓度、氯化钡的加入量等，经初步试验，前4个因素为主要影响因素，为此本试验对猪苓多糖硒配合物的合成进行单因素试验。

（1）进料流量对硒多糖的影响：在5L纯净水中，加入1g猪苓多糖和1g氯化钡（BaCl2在合成反应中起着催化作用［8］），配制浓度均为0.2mg／mL的猪苓多糖和氯化钡溶液，配制浓度为0.2mg／mL的亚硒酸钠溶液1L。亚硒酸钠溶液与多糖溶液流量比为0.5∶1，反应釜溶剂和多糖与亚硒酸钠溶液配比的加入流量总和800mL，调整硝酸加入量，使得反应釜中硝酸浓度为0.004mL／mL，超声辅助合成频率30kHz，合成温度30℃，选择进料流量分别为10，20，30，40，50mL／min，进行单因素试验，结果见图2。

图2 多糖进料流量对硒多糖合成率的影响Figure 2 Effects of polysaccharide feed flow on the Synthesis rate of Se－polysaccharide

由图2可知，当流量为30mL／min时，试验测得每克多糖中配合的硒离子含量最大，即合成率最大，且随着流量增加，合成率呈增大趋势，但当流量超过30mL／min时，硒多糖的合成率开始下降。究其原因，当流量小时，反应釜中多糖浓度不高，而亚硒酸钠溶液中的硒离子基本不变，多糖分子与亚硒酸根离子配位合成率随着多糖分子浓度的增加而增加；当多糖分子浓度超过一定值后，其分子与亚硒酸根离子配位竞争加剧，在催化作用下多糖分子与硒离子配位主要出现在多糖分子链的部分官能团附近，导致合成率反而下降，故多糖流量以30mL／min为较佳的流量。

（2）硝酸用量对硒多糖的影响：固定多糖、氯化钡、亚硒酸钠浓度均为0.2mg／mL，多糖液进料流量为30mL／min、亚硒酸钠溶液与多糖溶液流量比为0.5∶1、超声辅助合成频率30kHz、合成温度30℃，反应釜溶剂和多糖与亚硒酸钠溶液配比的加入流量总和800mL，调整硝酸量加入量，使得反应釜 中 硝 酸 浓 度 分 别 为 0.002，0.004，0.006，0.008，0.01mL／mL，进行单因素试验，结果见图3。

图3 硝酸用量对硒多糖合成的影响Figure 3 Effects of nitric acid on the synthesis rate of Se－polysaccharide

由图3可知，当硝酸浓度为0.008mL／mL时，合成率最大，此后随着反应釜中硝酸浓度的增加合成率下降。究其原因，当反应釜中硝酸浓度较小时，随着硝酸量的增加，溶液中多糖分子中硒化部位的官能团能量下降，使得反应速率加快，猪苓多糖硒络合物合成率增大；而当硝酸过量时，因为酸度过大可能会影响猪苓多糖上的羟基与亚硒酸酯化，同时也会使多糖分子进一步水解，硒化作用减弱，合成率下降。故硝酸加入量以0.008mL／mL为益。

（3）反应温度对硒多糖的影响：固定多糖、氯化钡、亚硒酸钠溶液的浓度为0.2mg／mL，多糖进料流量为30mL／min、亚硒酸钠溶液与多糖溶液流量比为0.5∶1、反应釜中硝酸浓度0.008mL／mL，超声辅助合成频率30kHz，选择反应温度分别为30，40，50，60，70℃，进行单因素试验，结果见图4。

图4 反应温度对硒多糖合成的影响Figure 4 Effects of reaction temperature on the synthesis rate of Se－polysaccharide

由图4可知，硒多糖合成率随着反应温度的增加先增加后减小，当温度为60℃时合成率最大。究其原因是因为温度升高，分子热运动增加，多糖分子与亚硒酸根离子碰撞几率增加，反应更为充分，合成率提高；但是温度过高时，亚硒酸根离子运动过于剧烈，而多糖分子热运动相对下降，不利于反应的进行，合成率下降；另外温度升高会导致猪苓多糖的水解，更不利于多糖的硒化。因此，反应温度以60℃为宜。

（4）反应物配比对合成率的影响：固定多糖、氯化钡、亚硒酸钠溶液的浓度均为0.2mg／mL，多糖进料流量为30mL／min，设定反应温度60℃、反应釜中硝酸浓度0.008mL／mL，超声辅助合成频率30kHz，改变亚硒酸钠溶液流量，使其与多糖溶液流量配比分别为0.5∶1，1∶1，1.5∶1，2∶1，2.5∶1，进行单因素试验，结果见图5。

由图5可知，硒多糖合成率随着反应物配比的增加先增加后大幅减小，当配比为1∶1时合成率最大。究其原因，当反应物配比偏小时，反应比较完全，猪苓多糖分子与硒离子碰撞机率高，合成率增大；当反应釜中亚硒酸根离子浓度偏大时，因多糖分子离子效应弱，而亚硒酸根离子离子效应强，配位合成竞争加剧，合成率反而下降。因此反应物配比以1∶1为宜。

2.2.2 正交试验结果与分析 在单因素试验的基础上，对多糖进料流量、反应釜中硝酸浓度、反应温度、反应物流配比4个因素进行L9（34）正交试验，因素水平见表1，正交试验结果见表2。

图5 反应物配比对硒多糖合成的影响Figure 5 Effects of liquid ratio on the synthesis rate of Se－polysaccharide

表1 因素水平表Table 1 The table of factors and levels

表2 正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments

由表2可知，影响猪苓多糖硒配合物的诸因素的主次关系为多糖进料流量＞反应物配比＞硝酸浓度＞反应温度，最佳合成条件为多糖进料流量30mL／min，反应物配比1∶1，反应 温 度70 ℃，硝 酸 浓 度0.008mL／mL，亚 硒 酸 钠0.2mg／mL，超声辅助合成频率30kHz，在此最佳条件下进行验证性实验3次，其平均合成率达26.5mg／g，即每克多糖中可配合26.5mg硒。

2.3 猪苓多糖与硒多糖抑菌性能试验

由表3可知，猪苓多糖及其硒多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母和黑曲霉抑菌作用存在差异，猪苓多糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果明显，而猪苓硒多糖对4种菌株的抑菌性能均明显。表明猪苓硒多糖的抑菌性能优于猪苓多糖。猪苓多糖及其硒多糖配合物对4种供试菌的最佳抑菌浓度见表4。

表3 两种多糖的抑菌圈直径表†Table 3 Antimicrobial ring diameter of different bacteria inhibited by two kinds Polysaccharide

表4 两种多糖的最佳抑菌浓度Table 4 The optimum inhibitory concentration of two kinds Polysaccharide ／（mg·mL－1）

以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉和啤酒酵母为供试菌，研究猪苓多糖及其硒多糖的最低抑制浓度，以抑菌圈直径D＝6.2mm为最低抑制效果区，结果见表5。

表5 两种多糖的最低抑菌浓度MICTable 5 MIC of two kinds Polysaccharide to different bacteria ／（mg·mL－1）

3 结论

（1）在超声波辅助作用下，对猪苓多糖液与催化剂氯化钡浓度和亚硒酸钠溶液的浓度均为0.2mg／mL来说，连续式合成猪苓硒多糖的最佳工艺条件为多糖进料流量30mL／min，亚硒酸钠溶液与猪苓多糖溶液流量配比1∶1，反应温度70℃，反应釜内硝酸的浓度0.008mL／mL，超声辅助合成频率30kHz，其合成率达26.5mg／g，即每克多糖中可配合26.5mg硒。

（2）猪苓多糖及其硒多糖配合物的抑菌性能研究表明，猪苓多糖及其硒多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母和黑曲霉抑菌作用存在差异，猪苓多糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果明显，而猪苓硒多糖对4种菌株的抑菌性能均明显；猪苓多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉的最佳抑菌浓度分别为 10.0，2.5，10.0，10.0mg／mL，而其最低抑菌浓度则分别为2.500，1.225，2.500，5.000mg／mL；猪苓硒多糖对4种菌株的最佳抑菌浓度分别为2.5，2.5，5.0，2.5mg／mL，而其最低抑菌浓度则分别为1.225，0.613，2.500，1.225mg／mL，数据显示，猪苓硒多糖的抑菌性能优于猪苓多糖。

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