ALDH1+、CD44+/CD24-重叠与乳腺癌基因亚型和临床因素的相关性研究
2013-09-07曾妮韩明利屈洪波朱志坤蔡建英陈力学吴诚义
曾妮,韩明利,屈洪波,朱志坤,蔡建英,陈力学,吴诚义
(重庆医科大学附属第一医院1.内分泌外科;2.重庆市神经病学重点实验室,重庆 400016)
ALDH1+或CD44+/CD24-表达是目前公认的检测分析乳腺癌干细胞较为广泛的标志物,在细胞成瘤实验中,ALDH1+CD44+CD24-已被证实成瘤能力和转移能力最强[1],而鲜见人类乳腺组织同例标本中重叠表达此两种干细胞标志物的情况研究。本实验使用免疫组化单染和双染技术联合检测我院203例乳癌患者标本中ALDH1和CD44/CD24表达情况,探讨分析它们在基因亚型中的分布及与临床各因素的关系。
1 材料与方法
1.1 临床资料
收集重庆医科大学附属第一医院2006年9月至2011年9月行乳腺癌改良根治术和B超引导下核心穿刺活检术患者的手术标本,术前均未接受放化疗、内分泌治疗、靶向治疗,术后石蜡病理报告均证实为乳腺癌,除外Ⅳ期乳腺癌、资料不完整或失访患者,纳入本次研究的乳癌患者共有203例,均为女性,其病理类型包括浸润性导管癌140例,浸润性小叶癌22例,髓样癌9例,黏液腺癌14例,其他类型癌18例。术后根据临床分期、ER、PR、Cerb-B2情况选择或联合放化疗、内分泌治疗、靶向治疗等。患者随访3~28个月,中位随访时间为12个月,随访方式主要为电话访问、门诊复查和本院病案科历史病历查询。
1.2 试剂与方法
1.2.1 试剂:ALDH1兔抗人多克隆抗体购于英国Abcam公司;CD24兔抗人单克隆抗体购于中国北京博奥森生物技术有限公司;CD44鼠抗人单克隆抗体、Polymer双染检测试剂盒、SP免疫组化染色试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒均购于中国北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2.2 实验方法:收集标本石蜡包埋,4 μm厚连续切片4张,1张行HE染色,另2张行免疫组化染色,1张备用。(1)免疫组化单染ALDH1:常规脱蜡水化,3%H2O237℃浸泡15 min,枸橼酸盐缓冲液微波热修复30 min,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤5 min 3次,3%正常羊血清培育25 min,加一抗(ALDH1兔抗人抗体工作液浓度1∶100)4℃过夜,复温1 h,PBS洗涤30 min,加入二抗37℃30 min,PBS洗涤30 min,显微镜下控制DAB显色,清水终止显色,苏木素染色4 min,盐酸酒精2 s,碳酸锂1 min,二甲苯20 min,乙醇梯度脱水,中性树胶封片。PBS代替一抗作为阴性对照。(2)免疫组化双染检测CD44+/CD24-的表达:CD44和CD24抗体的工作液浓度分别为1∶50和1∶100。实验步骤按双染试剂盒说明书进行,DAB和AP-Red显色,苏木素复染,用CD44和CD24单染免疫组化做对照。
1.2.3 结果判定:
1.2.3.1 免疫组化单染结果判定 ALDHl阳性细胞为细胞质和细胞膜棕黄色。根据显色细胞比例为染色结果评分。按阳性染色细胞比例评分:0~10%为阴性0分;10%~25%为阳性1+;25%~50%为阳性2+;超过 50%为阳性 3+[2]。
1.2.3.2 免疫组化双染结果判定 CD44阳性细胞为细胞膜棕黄色,CD24阳性细胞为细胞质红色,呈棕黄色无红色的细胞鉴定为CD44+/CD24-,结果判读参照Honeth等[3]的评分方法:无阳性细胞为0分;阳性细胞1%~<10%为1分;阳性细胞10%~<5 0%为2分;阳性细胞50%~<75%为3分;阳性细胞75%~100%为4分。0分为阴性,≥1分为阳性。
1.2.3.3 HER-2结果判定 根据重庆医科大学病理诊断中心报告,HER-2免疫组化染色不表达或“+”被判定为阴性,“++”或更高表达加用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH) 进行验证,FISH扩增为阳性,相反则为阴性。
1.3 统计学分析
采用SPSS 17.0软件进行统计学处理,计数资料采用χ2检验或Fisher精确概率检验,生存分析采用Kaplan Meier法、log-rank检验比较生存差异,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 ALDH1、CD44/CD24在乳腺癌基因亚型中的分布
ALDH1表达位于细胞质和(或)细胞膜,呈棕黄色;CD44表达位于细胞膜,呈棕黄色;CD24表达位于细胞质,阳性表达呈红色,棕黄色无红色为不表达,见图1。
2011年第12届国际乳腺癌会议将ER、PR、HER-2、Ki67表达情况制订5种新的乳腺癌基因亚型[4],本实验根据重庆医科大学病理诊断中心报告,203例乳腺癌中:Luminal A型39例 (19%);Luminal B (HER-2-)型90例(44%);Luminal B(HER-2+)型 21例(10%);HER-2型 22例(11%);Triple negative型31例(15%)。ALDH1阳性表达为20例(10%),主要在HER-2型(20%)和Triple negative型(40%)高表达,ALDH1阳性在乳腺癌各分子亚型中的表达差异具有统计学意义(P=0.006)。CD44+/CD24-表型为 84例(41%),Triple negative型乳腺癌组织中含CD44+/CD24-表型为24例(77%),明显高于其他分子亚型,差异具有统计学意义(P=0.000)。ALDH1+/CD44+/CD24-/low型为11例(5%),主要分布在HER-2型(18%)和Triple negative型(45%),差异有统计学意义(P=0.000),见表1。
表1 ALDH1、CD44/CD24及联合ALDH1、CD44/CD24在乳腺癌各分子亚型中表达的比较(例)Tab.1 The distribution of ALDH1+,CD44+/CD24-and the combination of ALDH1 and CD44/CD24 in breast cancer molecular subtypes(case)
2.2 ALDH1、CD44/CD24与乳腺癌患者临床病理特征的相关性
结果显示,ALDH1+表达与乳腺癌患者的年龄、肿瘤大小、淋巴结状态、病理类型、ER,PR等临床相关变量分布差异无统计学意义(P>0.05),而与临床分期有关(P<0.05);CD44+/CD24-、ALDH1+/CD44+/CD24-表型与乳腺癌患者的年龄、肿瘤大小、临床分期、淋巴结状态、ER,PR等临床相关因素无明显相关性(P>0.05),而与病理类型有关(P<0.05),见表2。
2.3 ALDH1、CD44/CD24与乳腺癌患者2年无病生
存率关系及复发和转移情况
ALDH1+患者2年无病生存率为55%,ALDH1-患者2年无病生存率为82%;CD44+/CD24-表型患者2年无病生存率为76%,非CD44+/CD24-表型患者2年无病生存率为83%;ALDH1+/CD44+/CD24-表型患者2年无病生存率为36%,明显低于其他类型,差异具有统计学意义(P<0.05),见图2。
3 讨论
表2 ALDH1、CD44/CD24与乳腺癌患者临床病理特征的关系Tab.2 Relationship between ALDH1,CD44/CD24 expressions and clinicopathological characteristics in patients with breast cancer
目前肿瘤干细胞的分选及标志物的准确选择成为“肿瘤干细胞学说”的瓶颈,乳腺癌干细胞标志物的选择主要集中在 ALDH1+、CD44+/CD24-之间[5]。CD44+/CD24-作为干细胞标志物具有组织特异性,即其只是乳腺癌干细胞标志物[6]。在本组实验中,表达CD44+/CD24-表型乳腺癌有84例(41%),主要存在于Triple negative型,很多研究认为CD44+/CD24-表型与 basal-like 型乳腺癌密切相关[2,7],Sheridan等[8]分析了13种乳腺癌细胞株,发现表达CD44+/CD24-表型的所有细胞系存在于基底的/间充质的/肌上皮的亚型细胞系中,表达CD44+/CD24-表型的乳癌细胞只表达基底/间叶/肌上皮细胞标志,缺乏管腔上皮细胞标志表达,他们认为表达CD44+/CD24-表型的乳腺癌细胞也许起源于基底的/肌上皮的细胞,并且CD44+/CD24-表型乳腺癌细胞高表达侵袭性基因,患者预后差。还有研究提示basal-like型乳腺癌可通过诱发EMT使非CD44+/CD24-表型乳腺癌细胞表达CD44+/CD24-表型[9],这也许是basal-like型乳腺癌高表达CD44+/CD24-表型的原因之一。本实验结果显示CD44+/CD24-表型与患者年龄、肿瘤大小、临床分期、淋巴结状态、ER,PR等临床相关因素无明显相关性,但与病理类型有关,主要存在于浸润性导管癌,CD44+/CD24-表型患者2年无病生存率较非CD44+/CD24-表型差,这与以往报道结果基本一致[10]。
ALDH1是一种氧化还原酶,参与细胞内的醛氧化过程[5],它作为肿瘤干细胞标志物没有组织特异性。在本组实验中,ALDH1+表达为20例(10%),符合干细胞只占肿瘤细胞极少比例的特性。主要在HER-2型(20%)和Triple negative型(40%)高表达,研究显示[11]ALDH1+与 BRCA1 因子密切相关,ALDH1+/ER-型乳腺干/祖细胞可通过BRCA1的作用分化为ALDH1-/ER+上皮细胞,BRCA1一旦缺失,将导致ALDH1+/ER-型乳腺干/祖细胞的遗传不稳定积累,最终导致管腔分化紊乱或管腔细胞凋亡进而发展成为乳腺癌。部分研究认为ALDH1+表达与HER-2过表达正相关,且ALDH1与HER-2是导致患者预后不良的危险因素[12],也有研究结果提示ALDH1与HER-2不相关,HER-2过表达与组织学分级、淋巴结转移无关[13],这也许能提示肿瘤来源不同[14,15]或代表不同的遗传变异[15]。ALDH1+与 CD44+/CD24-也许是通过不同层次来区别标志不同层次的乳腺癌干细胞[14],这也可能暗示着不同的癌干细胞标志物指向不同的乳腺癌干细胞类型。ALDH1+与CD44+/CD24-单独表达时,多数研究认为与患者临床相关因素无明显相关性,本组实验将两种标志物结合分析,得出重叠表达这两种标志物的乳腺癌患者2年无病生存率明显低于其他,这也许是结合两种标志物纯化了“癌干细胞群”,同时也可能代表了不同来源的癌干细胞,提示未来联合癌干细胞标志物也许能预测患者预后。
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