牛蒡根提取物不同组分体外肿瘤细胞毒作用

沈洪昇，赵秀梅，张富庚，胡人杰，史鹏程，顾娜

（天津市医药科学研究所，天津 300020）

牛蒡（Arctium lappa L.）是菊科牛蒡属植物。原产于我国，以野生为主，分布从东北至西南[1]。公元940年前后牛蒡传入日本，并被培养成优良品种，现在日本人把牛蒡根奉为营养和保健价值极佳的高档蔬菜。近年来的研究表明，牛蒡根具有抗菌、抗氧化和降血脂等方面的生物活性[2-3]。笔者在之前的实验中曾采用溶剂法对牛蒡根进行了初步的提取分离，得到的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇等4个不同极性提取物，在体外抗肿瘤活性筛选中，表现出明确的细胞毒作用，尤以石油醚和氯仿提取物活性最佳[4]。本研究采用硅胶柱层析法对石油醚和氯仿提取物进一步提取分离，MTT法比色法对这些洗脱组分进行体外抗肿瘤活性的测定，从而确定了牛蒡根中抗肿瘤有效成分的所在部位，为牛蒡根的综合利用提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

昆明种小鼠，体重18 g～22 g，雄性，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.1.2 瘤株

人的乳腺癌细胞株MCF-7、小鼠肝癌Hep A腹水型和肉瘤S180腹水型，由天津市医药科学研究所瘤源室提供。

1.2 药品与试剂

牛蒡根，市售，购自津工超市。切片晒干经粉碎机粉碎为干粉。

RPMI1640培养液：GIBCO公司，小牛血清：杭州四季青工程材料有限公司，MTT：北京欣经科生物技术有限公司。无水乙醇、正丁醇、石油醚（30－60℃）、氯仿、乙酸乙酯均为分析纯。

1.3 仪器

CO2孵育箱：TyTe公司；酶标仪：Labsystems Dragon公司。

1.4 方法

1.4.1 样品制备

1.4.1.1 牛蒡根石油醚、氯仿提取物的制备

牛蒡根干粉95%乙醇回流提取后，减压回收溶剂，浸膏加适量水使混悬，依次以石油醚、氯仿萃取。将各萃取液分别浓缩，得石油醚、氯仿提取物。

1.4.1.2 石油醚提取物硅胶柱层析分离组分的制备

100目～200目硅胶玻璃管柱湿法装柱，上样3 g；分别用氯仿；氯仿：甲醇 9 ∶1；氯仿：甲醇 8 ∶2；氯仿：甲醇7∶3过柱洗脱，最后甲醇冲柱。试验过程中用10 mL试管接取洗脱样品，每份5 mL。经TLC检测，选取斑点集中的合并，减压回收溶剂，将浓缩物再低温真空干燥后，称重并计算收率。

1.4.1.3 氯仿提取物硅胶柱层析分离组分的制备

100目～200目硅胶玻璃管柱湿法装柱，上样2 g；分别用氯仿 ∶甲醇8∶2、氯仿 ∶甲醇7∶3、氯仿 ∶甲醇2∶8洗脱，最后甲醇冲柱。试验过程中用10 mL试管接取洗脱样品，每份5 mL。经TLC检测，选取斑点集中的合并，减压回收溶剂。将浓缩物再低温真空干燥后，称重并计算收率。

1.4.2 样品对体外培养肿瘤细胞生长的影响

1.4.2.1 待测样品的配制

称取牛蒡根层析物10 mg，加入含10%小牛血清RPMI 1640溶液2 mL，于超声波仪中超声5 min，使浸膏充分溶解或混悬，配制成5 mg/mL的储备液。

精密吸取上述溶液适量，用含10%小牛血清的RPMI1640液配制成不同浓度的溶液。

1.4.2.2 细胞实验过程[5]

取对数生长期MCF－7细胞，经0.25%胰酶消化后，吹打成单细胞悬液，用含10%小牛血清的RPMI 1640液调整细胞浓度为1×105/mL，以每孔100 μL分别接种于96孔培养板中，培养24 h待细胞贴壁。另外再抽取荷瘤HepA及S180小鼠腹水，PBS洗涤2次，用含10%小牛血清的RPMI 1640液稀释成1×106/mL单细胞悬液，分别接种于96孔培养板中，每孔100 μL。

于上述96孔板中加入不同浓度的待测样品液100 μL，每个浓度平行4孔，样品设5个～8个浓度梯度组，对照组加入等体积含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，使反应体积为 200 μL。37℃、5%CO2培养箱中培养72h后，每孔加入5mg/mLMTT液10μL，37℃温育4 h，1 000 r/min离心10 min，小心吸去上清液，每孔加人180 μL DMSO，震荡，于酶标仪570 nm处测吸光度（OD）值。按公式计算细胞生长抑制率。细胞存活率对剂量对数线性回归计算IC50值。

抑制率（%）=（1－实验组OD值/细胞对照OD值）×100%

2 结果

2.1 牛蒡根硅胶柱层析分离的实验结果

牛蒡根石油醚提取物经柱层析后，得到3个种组分 S－1（黄色澄清油状物，677.4 mg）、S－2（褐色粘稠物，908.9 mg）和 S－3（深棕色粘稠的，766.4 mg）。牛蒡根氯仿提取物经柱层析后，得到4个种组分L－1（浅棕色粘稠状物质，138 mg）、L－2（浅棕色粉末，160 mg）、L－3（浅棕色粉末状提取物，660 mg）和L－4（浅棕色粉末，309 mg）。不同层析物得率结果，具体见表1。

表1 牛蒡根石油醚和氯仿提取物硅胶柱层析洗脱成分的得率结果Table 1 The yield of elution components from petroleum ether and chloroform extract of Burdock root

2.2 牛蒡根柱层析物对体外培养肿瘤细胞生长的影响

由表2、表4中结果可以看出，牛蒡根各层析物S－1、S－2、S－3 和 L－1、L－2、L－3、L－4 在各浓度范围内对MCF－7、Hep A和S180细胞的生长均表现出不同程度的抑制作用。对MCF－7细胞的IC50分别为832.3、76.24、＞500 μg/mL 和 131.31、147.01、315.95、＞500 μg/mL；对Hep A 细胞的 IC50分别为 398.42、97.97、253.04 μg/mL和 8.56、17.42、55.94、151.48 μg/mL；对 S180细胞的 IC50分 别 为 24.77、77.93、318.76 μg/mL 和 9.33、23.55、47.87、80.26μg/mL。相比较牛蒡根石油醚和氯仿提取物对三种细胞株的 IC50（222.59、59.07、52.86 μg/mL 和 265.93、76.80、73.62μg/mL）[4]，L－1 和 L－2 的细胞毒活性显著增强，样品的IC50至少降低了1.8倍以上。

表2 牛蒡根柱层析物对MCF-7细胞毒作用的结果Table 2 Cytotoxic effect of elution components from Burdock root on MCF-7 cell

表3 牛蒡根柱层析物对Hep A细胞毒作用的结果Table 3 Cytotoxic effect of elution components from Burdock root on Hep A cell

表4 牛蒡根柱层析物对S180细胞毒作用的结果Table 4 Cytotoxic effect of elution components from Burdock root on S180cell

3 讨论

牛蒡在我国具有丰富的植物资源，除其果实牛蒡子作为我国的法定药物外，其根、茎、叶均可作为草药使用[6]。人们对牛蒡的研究已有数十年的历史，研究目标主要集中于牛蒡子，其抗肿瘤成分及活性方面的研究已经比较深入 ，但对于牛蒡根的研究尚处于起步阶段，认识有限。目前牛蒡根作为一种潜在的具有预防癌症的保健蔬菜在日本受到欢迎，而且对植物药开发愈来愈加重视的欧美国家则已经将牛蒡根作为主要的药用部位来进行研究[9]。故进一步研究和评价牛蒡根的抗肿瘤作用，应该是非常有意义的一项工作。

本项研究中，笔者对有明确抗肿瘤活性的牛蒡根石油醚、氯仿提取物做进一步的柱层析分离后，得到的7个样品。选用MCF－7和小鼠肿瘤S180、Hep A肝癌细胞，观察各层析物对三种细胞的细胞毒活性的变化。结果，仅 S－1 对于 S180细胞、S－2对于 MCF－7 细胞较之粗提物，表现出较好的细胞毒活性。而其他的石油醚层析物其活性均有不同程度的下降。当氯仿提取物柱层析后，除L－4外，其他部位对三个细胞株的细胞毒活性都明显增加，尤以L－1、L－2活性增加最为明显。这就表明牛蒡根抗肿瘤活性部位应为氯仿层中分离的L－1、L－2。现代研究资料表明，牛蒡根中含有聚炔类化合物，此类化合物主要特点是除具有不饱和三键结构外，往往还含有烯的结构，因而具有抗癌、抗炎、抗氧化等生物活性[10]。那么本实验中所见牛蒡根的抗肿瘤生物活性，是否与其所含的“炔类化合物”相关，有待进一步考察。笔者将在今后的试验中，通过植化的方法（生物活性跟踪法）对L－1和L－2这两部分做进一步的分离、纯化，以期找到牛蒡根中明确的抗肿瘤活性成分。

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[1]丁景和.药用植物学[M].上海:上海科学技术出版社,1985:215

[2]弥春霞,姜明,任玉兰.野生牛蒡根提取物的抑菌作用研究[J].安徽农业科学,2010,38(33):18765－18767

[3]魏东.牛蒡抗氧化、降血脂保健功能研究[J].食品科学,2008,29(2):380－382

[4]赵秀梅,张富赓,沈洪升,等.牛蒡根4种提取物体外抗肿瘤活性的比较研究[J].中国药房,2012,2(15):1351－1353

[5]尹桂豪,章程辉,史海明,等.糯米香茶的生物活性研究[J].食品研究与开发,2009,30(3):18－20

[6]江苏新医学院.中药大辞典[J].上海:上海科学技术出版社,1977:431

[7]郑云枫,彭国平.牛蒡的化学研究进展[J].时珍国医国药,2005,16(2):153－155

[8]米靖宇,宋纯清.牛蒡子中木脂素类化合物的抗肿瘤及免疫活性[J].时珍国医国药,2002,13(3):168－169

[9]魏东,王连翠.牛蒡根的研究进展[J].安徽农业科学,2006,34(15):3716－3717

[10]赵秀梅,胡人杰.天然炔类化合物的研究现状[J].天津药学,2007,19(1):60－63