应用多重PCR方法鉴定蔬菜水果中的芽孢杆菌

岳鹏

（天津市食品研究所有限公司，天津 301609）

应用多重PCR方法鉴定蔬菜水果中的芽孢杆菌

岳鹏

（天津市食品研究所有限公司，天津 301609）

摘 要：建立的多重PCR方法与16S rDNA序列作为模板对细菌的分型鉴定具有较好的特异性，可快速准确鉴定芽孢杆菌的4个种属，在微生物检测方面有良好的实用前景。

关键词：芽孢杆菌；多重PCR；16S rDNA

实验室最常见的检测方法是根据菌体、菌落的特征和其生物化学反应来进行鉴定。而面对表型特征不很明显时很容易导致错判的现象，并且生化反应耗时耗力，往往需要数天时间才能完成。目前开发很多的试剂盒，如API和BIOLOG快速鉴定系统，测定步骤繁琐、成本高不能够满足快速、准确检测的需要。

1985年，Kary Mullis发明了PCR技术，PCR技术发展至今已延伸出很多不同种的变体，例如：递减PCR、逆转录PCR、热启动PCR、即时PCR、巢式PCR、多重PCR等。PCR反应是模仿细胞内发生的DNA复制过程，在体外由酶催化合成的特异性DNA片段。双链DNA在高温的作用下可以变性成单链，在有DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则对目标基因进行复制，当DNA的温度降低后又可以复性为双链。因此，通过控制温度的变化以达到DNA的变性和复性，加入合理设计的引物，DNA聚合酶和dNTP就可以完成特定基因的体外复制[1]。近年来随着核酸技术的发展，PCR技术16S rDNA常被用于细菌鉴定核糖体。16S rDNA基因序列全长约1 550 bp，是由交替的保守区和可变区组成，利用保守段和可变段组成设计的引物，可以确定其菌属以及同种菌属不同菌株的类别[2]。本文利用多重PCR技术，以最常见致病的芽孢杆菌为目的菌株，分离提纯出其16S rDNA为模板进行特异性扩增，PCR产物经NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中BLAST进行序列的比对，确定其细菌的种属。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

试验所用的蔬菜和水果选购自市场；PCR套装试剂盒（dNTPs、buffter、Taq 酶、Mg2+）：鑫国昌（北京）生物技术有限责任公司；限制性内切酶：郝佳（上海）科技发展有限公司；PCR引物的合成：杰瑞（北京）生物工程有限公司。

GeneAmp9700 PCR仪：美国应用生物系统公司；低温冷冻高速离心机：德国Eppendorf公司。

1.2 方法与PCR体系的建立

1.2.1 芽孢杆菌的提取与提纯

浸泡在7.5%氯化钠溶液中，再加热至90℃保持2 min，冷却后制成几个不同的10倍稀释液，分别进行平板涂布培养，分离的细菌经过革兰氏染色在显微镜下分离出芽孢杆菌23株（编号1-22）。

1.2.2 DNA的提取与提纯

16S rDNA的提取。细菌经24 h富集培养后，于5 500 r/min离心10 min，弃上清，沉淀物加入200 μL TE缓冲液、200 μL裂解液和0.5 g小玻璃珠，在振荡器上以4 000 r/min的速度击打1 min，反复3次。匀浆以12 000 r/min离心15 min，收集上清备用。上清液经氯仿和70%乙醇洗涤数次，保存在-20℃的TE缓冲液中。提取出的DNA经紫外分光光度计OD260/OD280进行DNA的纯度检测。

1.2.3 PCR反应体系的建立

拟用40 μL的反应体系，其中包括：0.2 μmol/L的特异性引物、3.75mmol/LMgCl2、200μmol/L 的 dNTP、5U Taq DNA聚合酶、1x PCR缓冲液和1 μg DNA模板。PCR引物模板选自文献[3-4]中的特异性引物，见表1。

表1 特异性引物模板Table 1 Primers for specific PCR

PCR反应循环为94℃1min；65℃90s，72℃2min；72℃for 10 min.反应循环为35次。产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 PCR产物测序

对扩增的DNA序列测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。测序结果分析由BioEdit Sequence Alignment Editor（Version 7.0.5.3）软件操作。测序结果与菌株之间的相似度比对由NCBI’s BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）软件进行。

2 结果与讨论

2.1 PCR产物的分析

以22株芽孢杆菌DNA为模板进行PCR扩增，其产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳在紫外灯下检测结果显示如图1。

图1 以22株芽孢杆菌的基因组DNA为模板的多重PCR扩增结果Fig.1 The multiplex PCR amplification of other representative strains using 16s rDNA as template

PCR产物的大小由NCBI blast软件完成预先的判定。B.subtilis的产物为256 bp、B.licheniformis的产物为356bp、B.pumilus为 321bp、B.cereus为 736bp。PCR 产物经凝胶电泳结果符合实验预期，1-5号为B.subtilis、13-18 号为B.licheniformis、19-22 号为B.pumilus、6-12号为B.cereus。限制性内切酶EcoRI选择用来对其中7、9、11号进行限制性内切酶实验，进一步确定其为B.cereus.结果经由 NEB cutter 2.0（http：//tools.neb.com/NEBcutter2/index.php）软件预测，其产物大小为两段，分别为230 bp和599 bp。7、9、11号PCR产物经限制性内切酶EcoRI实验，产物于1.2%凝胶电泳检测结果见图2。

图2 7、9、11号芽孢杆菌经限制性内切酶实验凝胶电泳图Fig.2 PCR products after digested with restriction enzyme（EcoRI）.1.2%agarose gel

2.2 PCR产物的序列分析

对分离出的芽孢杆菌菌株的特异PCR产物进行测序，结果通过GenBank中BLAST比对，与数据库中的同一区段核酸序列的同源性达到：枯草芽孢杆菌100%、地衣芽孢杆菌100%，蜡状芽孢杆菌100%，结果说明各特异性引物具有很强的保守性、特异性和忠实性。分离的22株芽孢杆菌分别为1-5号为B.subtilis、13-18 号为B.licheniformis、19-22 号为B.pumilus、6-12号为B.cereus。

3 结论

本文中用到的PCR方法可以为芽孢杆菌特别是蜡状芽孢杆菌的检测提供快速准确的技术支持。虽然多重PCR方法在微生物检测上做到快速、准确的优势，但是也有与其他一些芽孢菌发生交叉反应的可能[5]以常规方法与分子生物学技术结合，可取得事半功倍的效果。

：

[1]杨文敏,何敏．PCR扩增16S-23S rRNA区间序列在细菌检测与鉴定领域的应用[J]．广西预防医学,2000,6(6):369

[2]Kolbert C P,Persing D H.Ribosomal DNA sequencing as a tool for identification of bacterial pathogens[J].Curr Opin Microbiol,1999,2(3):299-305

[3]Kolusheva T,Marinova A.A Study of the Optimal conditions for starch hydrolysis through thermostable α-AMYLASE[J].Journal of the university of chemical technology and metallurgy,2007,42(1):93-96

[4]曹凤明,沈德龙,李俊,等.应用多重PCR鉴定微生物肥料常用芽孢杆菌[J].微生物学报,2008,48(5):651-656

[5]Buchanan R E,Gibbons N E.伯杰细菌鉴定手册[M].8版.中国科学院微生物研究所《伯杰细菌鉴定手册》翻译组，译.北京:科学出版社,1984:78-88

Application of Muti-PCR for Identification of Bacillus spp.in Vegetable and Fruit

YUE Peng
（Institute of Tianjin Food Co.，LTD.，Tianjin 301609，China）

Abstract：The rapid and accurate method established with multiplex PCR with high specificity as a template using 16S rDNA sequence for identification of the fourBacillus spp.

Key words：Bacillus spp.；Muti-PCR；16S rDNA

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.13.027

岳鹏（1985—），男（汉），助理工程师，硕士，从事微生物PCR鉴定工作。

2013-06-18