酶法提取山苍子精油研究

谢永芳，梁亦龙，王芳霞，熊文娟，徐亚，刘小赟

（重庆邮电大学生物信息学院，重庆 400005）

酶法提取山苍子精油研究

谢永芳，梁亦龙，王芳霞，熊文娟，徐亚，刘小赟

（重庆邮电大学生物信息学院，重庆 400005）

摘 要：以重组膨胀素和纤维素酶为材料，对山苍子进行破壁处理后于常压提取山苍子精油。检测山苍子精油提取得率。结果表明，常规蒸馏山苍子，所得精油为4.58，单位为ms/ks；纤维素酶解破壁山苍子精油，为12.35，纤维素酶加膨胀素酶解破壁山苍子提取为17.67，膨胀素酶加纤维素酶破壁的山苍子的精油含量最高，大约比纤维素酶解法高1/3。复合酶法提取山苍子精油效果最好。

关键词：山苍子；膨胀素；精油

山苍子，别名山鸡椒（Litsesa cubeba Pers），为樟科木姜子属植物，是我国的特有香料植物，在中西部资源十分丰富。由于其叶、果实含有大量挥发性油成分，其主要成分是柠檬醛。具有较强的抗菌作用，可治疗流行性感冒、平喘化痰、具有一定的抗过敏、抗血栓、抗心律失常、抗微生物及阴道滴虫、抗植物害虫、降解黄曲排毒素等作用。其独特的香味是合成香料无法比拟的，而且无毒副作用，因此在医药、香料工业以及化妆品上应用极为广泛。目前，关于从山苍子中提取精油的方法研究报道有很多，如蒸馏法、溶剂提取法、压榨法等[1-3]，但用酶解法提取精油的研究鲜有报道。该研究以低浓度的NaCl溶液作为盐析试剂，并协同生物酶法作用对山苍子精油的提取工艺进行研究，旨在探索出简便的提取工艺，为其资源的开发提供科学的参考。

1 材料与试剂

1.1 材料

山苍子：采于重庆南山植物园。川棉2802：重庆邮电大学生物信息学院药用植物重点实验室保存。

1.2 试剂

巴氏毕赤酵母菌株（P.pastors GSll5）和表达载体pPICZαA均为Invitrogen的产品。质粒pMD18-T、反转录试剂盒、限制性内切酶、DNA酶、dNTPs均购自为Takara公司产品。DNA片段回收试剂盒购自百泰克生物工程公司；Trizol、葡萄糖、3，5-二硝基水杨酸等化学试剂均为国产分析纯；纤维素酶由郑州龙和化工有限公司提供。

1.3 培养基

YPAD培养基：1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，0.01%腺嘌呤；LB培养基。

2 方法

2.1 棉花膨胀素（Ghexp）的获得[4]

2.1.1 引物设计与合成

根据棉花膨胀素基因序列（NCBI No．AF512542），利用Primer Premier 5.0软件设计基因特异性引物，引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

上游引物：TATTCAACACATCAGCAAGCTT下游引物：ACCCAATGCAGTAAAAGGGCCC

2.1.2 Ghexp克隆

棉种子萌发至2 cm～3 cm，提取总RNA。以总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链。具体反应体系和反应条件参照TaKaRa公司的RNA PCR试剂盒的使用说明[5]。以cDNA单链为模板，反应条件：95℃，5 min，1 次循环；（92 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min）30 次循环，最后72℃延伸10 min。经质量浓度1%琼脂糖电泳后，回收目的片段并连接pMD18-T载体，转化E.coli DH5α，提取质粒，限制性内切酶酶切鉴定正确后送交上海生物工程技术服务有限公司测序。

2.1.3 Ghexp的表达及酶活性检测

不含信号肽编码序列的Ghexp基因经双酶切后与采用同样酶切的表达载体pPICZαA连接，转化E.coli DH5α，提取质粒，经线性化后，根据毕赤酵母表达说明转化GS115菌株[6]。提取转化子基因组DNA进行PCR检测。用SDS-PAGE分析重组毕赤酵母培养液。利用膨胀素破坏滤纸结晶结构，使滤纸屑脱落的能力测定其活性。按照文献[7]的方法测定混合液的滤纸酶活性。

2.2 膨胀素、纤维素复合酶对山苍子的破壁处理

先称取100 g山苍子果实，加入500 mL含表达膨胀素的发酵液，放入组织匀浆器中匀浆。并移入锥形瓶中，向锥形瓶中2.5 g纤维素酶，6 gNaCl，将锥形瓶于42℃（恒温摇床中充分振荡。反应时间为24 h，反应完毕后，取混悬液镜检。同时用不加膨胀素，不加纤维素酶的做为对照。

2.3 精油提取

充分搅拌后冷藏静置（如果表面己有油层，可先取出，即得部分粗精油），利用高速离心机（3 000 r/min以上）分离油水混合液，得到粗精油；将粗精油进行精制（分子蒸馏），得到优质精油。常规蒸馏山苍子精油粉，记为s 1；纤维素酶解破壁山苍子精油，记为s 2；纤维素加膨胀素酶解破壁山苍子提取记为s3。提取出的挥发油用无水硫酸钠除去水分，密封置于-20℃冷藏。3次重复。精油提取率（ms/ks）=得油量／称取量。

3 结果与分析

3.1 Ghexp基因序列克隆

获得Ghexp基因序列，大小为760 bp的基因序列，验证序列准确性，经比对与No.AF512542的基因99%的同源性。结果见图1。

3.2 Ghexp的表达

Ghexp基因经酶切、连接、转化后，转化子经双酶切鉴定。经电转化毕赤酵母，提取转化重组子DNA进行PCR鉴定，以表达载体阳性对照，筛选阳性重组子。以阳性菌株DNA为模板，分别以合成的特异性引物进行PCR扩增，扩展长度与理论一致，说明Ghexp基因已经整合于毕赤酵母GS115的基因组中。Ghexp基因表达基因产物能够有效提高纤维素酶的滤纸酶活（30.21%）。滤纸崩解实验表明，经Ghexp基因表达的处理后的滤纸比GS115培养物上清液处理后的薄，透光性好，纤维较松软，边缘崩解明显。

图1 PCR扩增结果Fig.1 Amplification results of PCR

3.3 不同方式处理山苍子精油得率的比较

通过不同方式处理山苍子，常规蒸馏山苍子，所得精油记为s 1；纤维素酶解破壁山苍子精油，记为s 2；纤维素酶加膨胀素酶解破壁山苍子提取记为s3。结果如图 2 显示，s1 为 4.58 ms/ks，s2 为 12.35 ms/ks，s3 为17.67 ms/ks。

图2 不同方式提取精油的比较图Fig.2 Oil from Litsesa cubeba by several shell-broken power

从图2结果可见，膨胀素酶加纤维素酶破壁的山苍子的精油含量最高，大约比纤维素酶解法高1/3。

4 讨论

膨胀素（expansin）对细胞壁的松弛作用是在细胞壁中的纤维素微纤丝和基质多糖交叉处，以一种非水解方式作用于微纤丝表面，使多聚体网络间的非共价键（氢键）可逆断裂，从而聚合物可发生滑动，引起细胞壁的伸展，膨胀素的作用在于打断纤维素微纤丝与半纤维素之间的氢键，但不破坏营养物质。膨胀素与壁水解酶相互配合，能促进细胞壁膨胀，从而达到细胞的破壁但却不损失营养成分[10-13]。本实验引入基因工程手段，成功地构建了棉花Ghexp的表达载体，利用棉花膨胀素发酵液与纤维素酶共同作用能有效提高精油的得率，其精油的提取较机械破壁法、单独使用纤维素酶更高，大约比纤维素酶解法高1/3，为17.67。用此法可节约成本，相对经济有效，发酵液中添加的甲醇，可以通过离心弃去，在大规模生产中，精油在蒸馏过程中甲醇等有害物质可以被去除干净，不具危害性。因此，使用基因工程产物膨胀素可成为值得探索的一种提取精油的新方法，本研究表明复合酶法提取精油比单纯的纤维素酶法提取、蒸馏法提取要效率高。

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[1]张德权,吕飞杰,台建祥.超临界CO2流体技术萃取山苍子油的研究[J].食品与发酵工业,2000,26(2):54-57

[2]周欣,莫彬彬.黔产山苍子油化学成分的气相色谱/质谱分析[J].贵州大学学报:自然科学版,2001:18(1):45-47

[3]万德光,陈幼竹杨叶木姜子果实的挥发油成分分析[J].天然产物研究与开发,2004,16(2):136-137

[4]Harmer S E,Orford S J,Timmis J N.Characterization of six alphaexpansin genes in Gossypium hirsutum(upland cotton)[J].Mol Genet Genomics,2002,268:1-9

[5]Xie Y F,Wang B C,Li B,et al.Construction of cDNA library of cotton mutant(Xiangmian-18)library during gland forming stage[J].COLLOIDS AND SURFACES B-BIOINTERFACES,2007,60(2):258-263

[6]郭梅,路福平,蒲军,等.杂色云芝漆酶基因在甲醇毕赤酵母中表达条件研究[J].食品研究与开发,2005,27(4):82-84

[7]黄萍,刘刚,余少文,等.黄瓜膨胀素的重组表达及活性分析[J].生物技术,2006,16(2)23-26

[8]罗曼,蒋立科.安徽黄山山苍子香精油成分GC-MS分析[J].作物研究,2006(3):256-258

[9]万德光,陈幼竹.杨叶木姜子果实的挥发油成分分析[J].天然产物研究与开发,2004,16(2):136-137

[10]李连朝,王学臣,荆家海.大豆幼苗下胚轴扩张蛋白的存在及其特性[J].植物学报,1998,40(7):627-634

[11]McQueen-Mason S J,Danlel M Durachko.Two endogenous proteins that induce cell wall expansion in plants[J].Plant Cell,1992,4(11):1425-1433

[12]Hayama H,Shimada T,Haj I T.Molecular cloning of a ripening related expansin cDNA in peach:evidence for no relationship between expansin accumulation and change in fruit firmness during storage[J],Journal of Plant Physiology,2000,157(5):567-573

[13]陈爱国,陈进红.Expansin的研究进展[J].植物学通报,2003,20(6):752-758

Study on Enzymatic Extraction of Litsea Cubeba Pers Oil

XIE Yong-fang，LIANG Yi-long，WANG Fang-xia，XIONG Wen-juan，XU Ya，LIU Xiao-yun
（College of Bioinformatie，Chongqing University of Post and Telecommunication，Chongqing 400005，China）

Abstract：Based on the heterologous expressed expansin and the cellulase，we study on treating Litsesa cubeba Pers.The broken cell wall can be made by cellulase and expansin.The production oil was elucidated.The result showed that it was higher by using compound enzymes than by conventional distillation and cellulose enzyme to break wall.The essential oil was 4.58 ms/ks by conventional distillation，Cellulose enzyme wall-breaking had 12.35 l oils，it was 17.67 by cellulase and expansin over 1/3 higher than cellulose enzymatic hydrolysis.The best effect is by composite enzyme to get oil.

Key words：Litsesa cubeba pers；expansin；oil

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.14.016

重庆市科委基金（cstc D2009-17）；重庆市教委基金（KJ130520）

谢永芳（1971—），女（苗），副教授，博士，研究方向：生物工程。

2012-10-09