酶法合成异VC混合脂肪酸酯及其抗氧化性能

郑大贵，祝显虹，余泗莲，彭化南，俞飞，毛刘量

（1.上饶师范学院江西省普通高校应用有机化学重点实验室，江西上饶 334001；2.百勤异VC钠有限公司，江西德兴 334221）

酶法合成异VC混合脂肪酸酯及其抗氧化性能

郑大贵1，祝显虹1，余泗莲2，彭化南1，俞飞1，毛刘量1

（1.上饶师范学院江西省普通高校应用有机化学重点实验室，江西上饶 334001；2.百勤异VC钠有限公司，江西德兴 334221）

摘 要：在Lipozyme 435脂肪酶催化下，利用异VC与山茶油、猪油、麻油和菜籽油分别发生酯交换反应，合成异VC混合脂肪酸酯，产物用柱层析法分离纯化。以山茶油与异VC反应为例，详细考察了反应溶剂、反应时间、反应物配比、酶用量和油脂回收循环使用对反应转化率的影响。优化条件下，反应转化率最高达到48%。将合成的异VC山茶油脂肪酸酯、异VC猪油脂肪酸酯、异VC芝麻油脂肪酸酯和异VC菜籽油脂肪酸酯应用于新鲜山茶油中，用过氧化值法（POV）进行抗氧化试验。结果表明，异VC混合脂肪酸酯是良好的脂溶性抗氧化剂，并表现出明显的剂效关系。

关键词：异VC；脂肪酶；异VC混合脂肪酸酯；油脂；抗氧化性

将VC（L-抗坏血酸）或异VC（D-异抗坏血酸）衍生为高级脂肪酸酯的方法有化学合成法和生物酶催化法。化学合成法副反应较多，同时不适用于不饱和脂肪酸酯的合成。生物酶催化法具有催化效率高、特异性好、环境友好等优点，已被用于VC脂肪酸酯的合成[1-6]。另外，动植物油脂对人体具有丰富的营养价值，文献[7-10]公开或报道了利用猪油、棕榈油和豆油在脂肪酶催化下合成VC混合脂肪酸酯的方法，它们涉及到先将相应的油脂与甲醇发生酯交换反应生成混合脂肪酸甲酯，然后利用VC与混合脂肪酸甲酯发生酯交换反应制备VC混合脂肪酸酯，合成和分离纯化过程较复杂。

利用异VC与山茶油、猪油、麻油和菜籽油分别发生酯交换反应，合成异VC混合脂肪酸酯。以山茶油与异VC反应为例，考察了反应溶剂、反应时间、反应物配比、脂肪酶用量和油脂回收循环使用对反应转化率的影响，优化了合成反应条件。将异VC山茶油脂肪酸酯、异VC猪油脂肪酸酯、异VC芝麻油脂肪酸酯和异VC菜籽油脂肪酸酯分别应用于新鲜山茶油中，用过氧化值（POV）法进行抗氧化试验，并与VC棕榈酸酯、异VC棕榈酸酯的抗氧化性进行了比较。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

异VC：德兴百勤异VC钠有限公司（≥99.9%）；Lipozyme 435脂肪酶（以下简称脂肪酶）：诺维信广州明远工贸有限公司；山茶油、猪油、芝麻油和菜籽油：购自当地农贸市场；VC棕榈酸酯和异VC棕榈酸酯按照文献[11]方法合成；其它试剂均为分析纯。

SHA-B水浴恒温摇床：江苏金坛市金南仪器制造有限公司；旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；TG328A电光分析天平：上海第二天平仪器厂；DSQ低分辨质谱仪：美国Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 异VC混合脂肪酸酯的合成和纯化

在脂肪酶存在下，异VC与油脂在叔丁醇中发生酯交换反应；反应结束后，过滤除去脂肪酶和未反应的异VC；滤液旋转蒸发去除叔丁醇后加入乙酸乙酯和水，进一步去除其中未反应的异VC；乙酸乙酯相用无水硫酸钠干燥，旋转蒸发去除乙酸乙酯，得到粗产物；粗产物经柱层析分离纯化，得到蜡状固体。

1.2.2 反应转化率的测定

准确称取一定量纯化后的产物，用95%乙醇溶解后，用碘量法[12]测定并换算成产物中含异VC结构单元（A，mmol数），计算相对于反应所用的异VC物质的量（B，mmol数）的转化率。

1.2.3 抗氧化性能的测试[13]

称取一定量的抗氧化剂于烧杯中，用少量无水乙醇溶解，然后加入到指定量的新鲜山茶油中，超声振荡下使油样与抗氧化剂混合均匀，放入烘箱中，缓慢加热并在升温过程中不断搅拌，待油样与抗氧化剂成均相后，恒温在60℃。每隔12小时充分搅拌1次并交换油样在烘箱中的位置，每隔48小时取3份平行样品，按GB/T5009.37-2003《食用植物油卫生标准的分析方法》进行POV测定，取平均值。对照样（CK）为不加任何抗氧化剂，其它操作相同。

2 结果与讨论

2.1 合成

以下的优化条件试验，我们采用Lipzome 435脂肪酶供应商建议的酶促反应温度55℃。每0.88克异VC用反应溶剂20 mL。

2.1.1 溶剂种类对反应转化率的影响

固定反应温度55℃、反应时间24 h、摇床转速180 r/min、脂肪酶0.132 g、异VC0.88 g和山茶油4.00 g，在20 mL不同的溶剂中反应，考察溶剂种类对反应转化率的影响，结果见表1。

表1 溶剂种类对反应转化率的影响Table 1 The effect of reaction solvents on the conversion

表1的结果表明，在所选的溶剂中，以叔丁醇的效果最好。以下的实验选取叔丁醇为反应溶剂。

2.1.2 反应时间对反应转化率的影响

固定反应温度55℃、摇床转速180 r/min、脂肪酶0.132 g、异VC0.88 g和山茶油4.00 g，在20 mL叔丁醇中反应不同的时间，考察反应时间对反应转化率的影响。结果见表2。

表2 反应时间对反应转化率的影响Table 2 The effect of reaction time on the conversion

表2的结果表明，在给定条件下，反应转化率随着反应时间的延长而升高，但30 h以后，升高缓慢。以下的实验选取反应时间30 h。

2.1.3 反应物配比对反应转化率的影响

固定反应温度55℃、反应时间30 h、摇床转速180 r/min、脂肪酶 0.132 g、异 VC0.88 g（5 mmol），改变山茶油的用量（分别为 3、4、6、8、10 g，假定山茶油的平均分子量为800，然后换算成物质量的比），在20 mL叔丁醇中进行反应，考察反应物配比对反应收率的影响。结果见表3。

表3 反应物配比对反应转化率的影响Table 3 The effect of the ratio of reactants on the conversion

表3的结果表明，在给定条件下，反应物配比以n（异Vc）∶n（山茶油）=1.0∶1.5时转化率最高。之后，增大山茶油的用量，转化率反而降低，可能的原因是山茶油的用量过大时，反应混合物变稠，传质受到影响。

2.1.4 酶用量对反应转化率的影响

固定反应温度55℃、反应时间30 h、摇床转速180 r/min、n（异 VC）∶n（山茶油）=1.5∶1.0（异 VC0.88 g，山茶油6.0 g），改变脂肪酶的用量[w（酶）为所用异VC的质量百分数]，在20 mL叔丁醇中进行反应，考察酶的用量对反应转化率的影响，结果见表4。

表4 酶的用量对反应转化率的影响Table 4 The effect of the amount of lipase on the conversion

表4的结果表明，随着酶用量的增大，转化率提高。在酶催化反应中，酶的用量越大，催化活化中心越多，酶与反应底物接触的机会也越大，酯化反应速率加快[14]。

2.1.5 油脂回收循环使用对反应转化率的影响

固定反应温度55℃、反应时间30 h、摇床转速180 r/min、异 VC0.88 g、山茶油 6.0 g、脂肪酶 0.176 g和叔丁醇20 mL的条件下反应。用新鲜山茶油和反应回收的山茶油的反应转化率分别为45.8%和43.6%；用新鲜猪油和反应回收的猪油的反应转化率分别为40.9%和38.70%。结果表明，用新鲜油脂和用反应回收的油脂进行的反应，转化率相差不大，说明油脂可以回收循环使用。

2.1.6 优化条件下的合成结果及其产物表征

根据上述优化条件，放大实验，过程及其结果如下。

具塞锥形瓶中，加入异 VC3.52 g（20 mmol）、新鲜山茶油24.0 g、脂肪酶0.70 g和叔丁醇80 mL，放入恒温摇床中，在55℃、摇床转速180 r/min条件下反应30 h。反应结束，过滤去除脂肪酶、旋转蒸馏去除叔丁醇，加入乙酸乙酯80 mL和蒸馏水80 mL，充分搅拌混合后，分出乙酸乙酯层。乙酸乙酯层继续用蒸馏水洗至水层至无异VC残留，无水硫酸钠干燥，去除乙酸乙酯后得到粗产物25.7 g。

量取约200 mL硅胶，用石油醚湿法装柱，粗产物直接上柱后，用约300 mL二氯甲烷缓慢洗脱硅胶柱，放干柱中二氯甲烷，截取硅胶柱上端前1/4的硅胶，用乙酸乙酯萃取产物，旋转蒸发去除乙酸乙酯后用油泵真空干燥0.5 h，得到蜡状固体4.61 g。碘量法测得含异VC结构单元9.60 mmol，基于异VC的反应转化率为48.0%。

合并洗脱硅胶柱的二氯甲烷溶液，常压蒸除二氯甲烷，得到回收山茶油19.1 g。

用新鲜猪油、芝麻油、菜籽油代替新鲜山茶油，按上述方法进行实验，结果见表5。

表5 异VC混合脂肪酸酯合成反应结果Table 5 Synthesis reaction results of D-isoascorbyl mixed-fatty acid esters

经柱层析纯化的异VC山茶油脂肪酸酯、异VC猪油脂肪酸酯、异VC芝麻油脂肪酸酯和异VC菜籽油脂肪酸酯的EI-MS谱图分别出现m/z=440、m/z=438、m/z=438和m/z=440的峰。其中，m/z=438为异VC亚油酸酯的分子离子峰，m/z=440为异VC油酸酯的分子离子峰。

2.2 抗氧化性能

2.2.1 不同添加量的异VC山茶油脂肪酸酯在山茶油中的抗氧化性能

以异VC山茶油脂肪酸酯为例进行剂效试验。将异VC山茶油脂肪酸酯分别以0.013%、0.026%、0.039%和0.052%的添加量加入到新鲜山茶油中，按1.2.4所述方法进行抗氧化试验，结果见图1。

由图1可知，与对照样CK比较，异VC山茶油脂肪酸酯在山茶油中的抗氧化性随着其添加量的增加而提高，表现出明显的剂效关系。这是因为，油样中异VC山茶油脂肪酸酯的浓度越大，提供的烯二醇结构单元就越多，表现出的抗氧化能力就越强[15]。

2.2.2 不同抗氧化剂抗氧化性能的比较

图1 不同添加量的异VC山茶油脂肪酸酯在山茶油中的抗氧化性能Fig.1 Antioxidation activities of different amount of D-isoascorbyl camellia oil fatty acid esters in camellia oil

GB2760-2011《食品安全国家标准》规定，VC棕榈酸酯在食用油脂中的最大使用浓度以油脂中VC计为0.02%。参考此用量，根据有关化合物的相对分子质量（VC棕榈酸酯和异VC棕榈酸酯相对分子质量为414，假定异VC混合脂肪酸酯平均相对分子质量为440）对添加量进行换算后，将异VC山茶油脂肪酸酯、异VC猪油脂肪酸酯、异VC麻油脂肪酸酯、异VC菜籽油脂肪酸酯、VC棕榈酸酯和异VC棕榈酸酯分别添加到新鲜山茶油中，按1.2.3所述方法进行抗氧化试验，结果见图2。

图2 不同异VC混合脂肪酸酯在山茶油中的抗氧化性能Fig.2 Antioxidation activities of different D-isoascorbyl mixedfatty acid esters in camellia oil

图2的结果表明，在所试条件下，所有4种异VC混合脂肪酸酯的抗氧化性能均略比VC棕榈酸酯和异VC棕榈酸酯的抗氧化性能好；异VC山茶油脂肪酸酯、异VC猪油脂肪酸酯、异VC麻油脂肪酸酯、异VC菜籽油脂肪酸酯之间的抗氧化能力相当。

3 结论

1）在Lipozyme 435脂肪酶催化下，利用异VC与山茶油、猪油、麻油和菜籽油在叔丁醇中分别发生酯交换反应，合成并用柱层析法分离纯化了4种异VC混合脂肪酸酯。优化了合成反应条件，在反应温度55℃、反应时间30 h、摇床转速180 r/min、异VC0.88 g、油脂6.0 g、脂肪酶0.176 g和叔丁醇20 mL的条件下反应，反应的转化率最高。

2）抗氧化试验结果表明，在以油脂中异VC（或VC）计添加量均为0.02%时，合成的4种异VC混合脂肪酸酯的抗氧化效果相当，略优于VC棕榈酸酯和异VC棕榈酸酯。

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Lipase-catalyzed Synthesis of D-isoascorbyl Mixed-fatty Acid Esters and Their Antioxidation Activities

ZHENG Da-gui1，ZHU Xian-hong1，YU Si-lian2，PENG Hua-nan1，YU Fei1，MAO Liu-liang1
（1.Key Labortatory of Applied Organic Chemistry，Higher Institutions of Jiangxi Province，Shangrao Normal University，Shangrao 334001，Jiangxi，China；2.Parchn Sodium Isovitamin C Co.，Ltd.，Dexing 334221，Jiangxi，China）

Abstract：D-isoascorbyl mixed-fatty acid esters were synthesized with Lipozyme 435 as catalyst by the transesterification of D-isoascorbic acid with camellia oil， lard， sesame oil and canola oil， respectively.The effect of factors such as reaction solvent， reaction time， the ratio of reactants， the amount of lipase， and the recycled oils and fats on the reaction conversion were explored with the synthesis of D-isoascorbyl camellia oil fatty acid esters as reaction model to optimize the reaction conditions.Under the optimized conditions，the reaction conversion could reach 48%.The antioxidation activities of D-isoascorbyl camellia oil fatty acid esters， D-isoascorbyl lard fatty acid esters， D-isoascorbyl sesame oil fatty acid ester and D-isoascorbyl rapeseed oil fatty acid ester in camellia oil was tested by POV determination，respectively.The results showed that all the synthesized D-isoascorbyl mixed-fatty acid esters were excellent fat-soluble antioxidants and that their antioxidation activities increased with the applied concentration.

Key words：D-isoascorbic acid；lipase；D-isoascorbyl mixed-fatty acid ester；oils and fats；antioxidation

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.14.003

江西省普通高校重点实验室科技计划项目（GJJ08523号）；江西省科技条件平台建设项目（2010DTZ01900）

郑大贵（1960—），男（汉），教授，主要从事有机食品添加剂的合成及应用研究。

2012-12-22