胃癌组织中 c-FLIP、NF-κB p65 的表达变化及意义

陈 军，覃思繁，林思彤，韦常宏

(广西医科大学附属肿瘤医院，南宁 530021)

目前，胃癌的发生机制尚未阐明，其侵袭和转移的分子调控机制研究是分子生物学研究的热点问题之一。其中，Fas介导的凋亡抑制在乳腺癌细胞的生长过程中有重要的作用。细胞型Fas相关的死亡区域蛋白样白介素-1转换酶抑制蛋白(c-FLIP)被认为是一种重要的细胞凋亡抑制蛋白。细胞核因子kappa B(NF-κB)是一种广泛存在的转录因子，在多种肿瘤组织内呈活化状态，在肿瘤细胞生长、增殖及浸润转移等方面发挥重要的作用。近年来，我们采用免疫组化法检测胃癌组织中的c-FLIP和NF-κB p65，观察其表达变化，旨在探讨两者在胃癌发生、发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2004年1月～2006年6月本院收治的胃癌患者80例，男48例，女32例;年龄25～68(40.1±13.2)岁。患者术前均未行任何治疗。手术留取胃癌组织标本80份(胃癌组)，所有标本均经病理证实。临床分期Ⅰ、Ⅱ期36例，Ⅲ期44例;肿瘤直径≥3 cm 52例，＜3 cm 28例;浸润至黏膜及肌层44例，浆膜及浆膜外36例;组织学类型为管状腺癌34例，乳头状腺癌20例，黏液腺癌14例，印戒细胞癌12例;分化程度为高、中分化50例，低分化30例;淋巴结转移35例，术后复发29例。留取同组病例的癌旁组织(均距肿瘤边缘5 cm)80份(癌旁组)作为对照。

1.2 试剂 c-FLIP浓缩型兔抗人多克隆抗体(美国Neomarkers公司)，抗体稀释浓度为1∶100。NF-κB p65浓缩型鼠抗人单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，抗体稀释浓度为1∶100。即用型快捷MaxvisionTM检测试剂盒(福州迈新生物技术科技公司)。

1.3 c-FLIP、NF-κB p65 的检测 采用免疫组化Envision两步法。整个过程按试剂盒说明书进行。每批染色均设已知阳性切片作阳性对照，用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。结果判断标准:c-FLIP表达产物主要定位于细胞质，呈棕黄色颗粒为阳性细胞(见图1)。NF-κB p65的阳性表达以细胞核和细胞质出现棕褐色颗粒为准(见图2)。由两位医师采用双盲法观察每张切片。阳性判断根据染色程度和免疫阳性细胞占肿瘤细胞总数百分比综合记分。按切片中癌细胞染色强度计分:0分细胞无显色，1分呈淡黄色，2分呈棕黄色，3分呈棕褐色(染色深浅需与背景着色相对比);再按切片中阳性癌细胞数所占百分比打分:0分为阴性，1分为阳性癌细胞≤10%，2分为11% ～50%，3分为50% ～75%，4分为75%以上。染色强度与阳性细胞百分比的乘积＞3分计为阳性。

图1 c-FLIP在胃癌中表达阳性(Envision两步法，100×)

1.4 统计学方法 采用SPSS11.0统计软件。数据比较用χ2检验，相关性分析用Spearman相关分析法。检验水准α=0.05。

图2 NF-κB p65在胃癌中表达阳性(Envision两步法，100×)

2 结果

2.1 c-FLIP、NF-κB p65的表达 胃癌组、癌旁组c-FLIP 阳性率分别为 67.50%(54/80)、45.00%(36/80)，NF-κB p65 阳性率分别为 70.00(56/80)、51.25%(41/80)，P 均 ＜0.05。

2.2 c-FLIP、NF-κB p65 的表达与胃癌临床病理特征的关系 见表1。由表1可知，c-FLIP的表达与胃癌临床分期、分化程度、淋巴结转移、术后复发相关(χ2值分别为 0.039、0.019、0.035、0.028，P 均 ＜0.05)，NF-κB p65 的表达与胃癌浸润深度、分化程度、淋巴结转移相关(χ2值分别为 0.019、0.012、0.001，P 均 ＜0.05)。

表1 c-FLIP、NF-κB p65表达与胃癌临床病理特征的关系

2.3 相关性分析 Spearman相关分析示，c-FLIP和NF-κB p65在胃癌组织中表达呈正相关(r=0.303，P=0.006)。

3 讨论

细胞凋亡是一种由基因控制的自主性有序死亡，是生理性细胞死亡过程，对保持正常生长及自身稳定有十分重要意义。肿瘤细胞通过影响内源性及外源性的机制来逃避凋亡。c-FLIP是Fas/FasL细胞凋亡信号传导途径的抑制蛋白，在肿瘤坏死因子受体超家族的死亡受体抑制中扮演重要角色。FLIP的死亡效应结构域与FAD和Caspase-8结合，竞争性抑制Caspase-8结合到死亡诱导复合体上，从而阻断了Fas介导的凋亡信号的传导［1］。研究表明，c-FLIP具有双重功能，FasL和c-FLIP的浓度对信号的传导具有决定性作用，高浓度存在于细胞中时会抑制Fas介导的凋亡;相反，在低浓度或生理情况下，则发挥促凋亡作用［1，2］。故推测 c-FLIP 过量表达在肿瘤发生中起重要作用。Ryu等［3］检测了52例大肠腺癌组织，其阳性表达率为78.8%，显著高于大肠息肉和癌旁正常组织。本研究胃癌组c-FLIP阳性率明显高于癌旁组，提示胃癌组织中c-FLIP蛋白表达水平增高，抑制肿瘤细胞的凋亡，从而促进了肿瘤的发生及进展。本研究还发现，c-FLIP的高表达与胃癌临床分期、分化程度、淋巴结转移及术后复发相关，提示其在胃癌的发展过程中亦起着十分重要的作用。

NF-κB是1986年Sen和Baltimore首先从B淋巴细胞核抽提物中检出的，其是可与免疫球蛋白的轻链基因增强子κB序列特异结合的核蛋白因子，最常见的是以p50/p65异二聚体形式存在于细胞质中。当NF-κB结合位点接受多种免疫刺激，如肿瘤坏死因子、IL-1、脂多糖等激活蛋白激酶，致使NF-κB的抑制物IκB磷酸化而解离，NF-κB二聚体被激活进入细胞核，从而激活基因表达［4］。在肿瘤发生的实验研究中，NF-κB的组成型激活与致瘤性转化有关［5］。研究发现，在多种恶性肿瘤均有NF-κB的激活，NF-κB可能通过调控与细胞生长增殖、抗凋亡、血管生成和转移的相关基因表达有关，促进了恶性肿瘤的发展［6］。本研究胃癌组NF-κB阳性率明显高于癌旁组，且表达与胃癌浸润深度、分化程度、淋巴结转移、术后复发相关，虽与Biswas等［7］研究结果不尽相同，但亦提示其在胃癌的发生、发展中可能发挥着重要的作用，对胃癌的预后与治疗有一定的指导意义。

从理论上分析，c-FLIP基因编码序列中存在κB位点，故肿瘤细胞中高表达活化的NF-κB蛋白可以上调FLIP的转录表达，使肿瘤细胞免于Fas、TRAIL介导的凋亡信号的调控［8］。Kataoka 等［9］发现，FLIP诱导NF-κB激活能被负相TRAF2显著抑制，并且内源性TRAF2特异的与FLIP相互作用，形成FLIPCaspase-8-TRAF2三聚复合体结构为诱导NF-κB激活所必需。另有许多文献报道，抑制肿瘤细胞的NF-κB活性可提高TRAIL的促凋亡作用，并有 c-FLIP的表达下降，提示NF-κB通路可能通过FLIP来抑制 TRAIL的促凋亡作用［10］。本研究发现，c-FLIP和NF-κB p65在胃癌中表达呈正相关，提示两者在胃癌的发生、发展中起着协同作用。

总之，c-FLIP、NF-κB p65 高表达在胃癌的发生及发展中起重要作用，两者可能是胃癌细胞凋亡信号传导网络中重要的一环，但其具体作用机制尚待进一步研究阐明。联合检测两者在胃癌中的表达情况对胃癌诊断、病情进展的评估及预后判断有重要意义，并可为胃癌的基因靶向治疗提供了新的途径。

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